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VL 3 - Mechanismen der Zelldifferenzierung II, Epigenetik

BP10 Zusammenfassung von VL 3 aus 2020
Kurs

Entwicklungsbiologie/Genetik

31 Dokumente
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Akademisches Jahr: 2019/2020
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Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

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Bio

Text Vorschau

VL ϯ – MECHANI“MEN DE‘

)ELLDIFFE‘EN)IE‘UNG II

Die erste Möglichkeit der Zelldifferenzierung erfolgt durch Transkriptionsfaktoren, posttranslationale Modifikationen etc. Es gibt allerdings noch ein zweites Prinzip, das unabhängig von der Summe aller Transkriptionsfaktoren der Zelle existiert.

Es gibt also diese 2 Mechanismen der Genregulation

 Summe aller Transkriptionsfaktoren (Masterregulatoren + alles andere)  Epigenetik (DNA- und Histon-Modifikation)  Führt alles zu einem stabilen Genexpressionsmuster

EPI GEN ET IS CH E M ECHA N IS ME N

Hierbei geht es um die Zugänglichkeit der DNA, also der Anordnung des Chromatins. Wenn die DNA gar nicht zugänglich ist, dann haben auch Transkriptionsfaktoren keinen Einfluss. In verschiedenen Entwicklungsstadien kann die DNA unterschiedlich zugänglich sein.

DEFI N I TI ON EP I GEN ETI K

 ͞Merkŵale, die ŶiĐht auf der Priŵärstruktur der DNA Đodiert siŶd, aďer ǁeiter ǀererďt ǁerdeŶ͞ (Die Entscheidung muss stabil gemacht werden.)

 Modifikationen von o (1) DNA (Methylierung) o ;ϮͿ HistoŶeŶ ;͞Histone-Code͟Ϳ

 Bindung von weiteren Proteinen

Bsp.: Bar-Körperchen: durch epigenetik wird das zweite X-Chromosom inaktiviert (Dosage Compensation)

FEED BA C K -MEC H A N I SMEN

Kontrolle der Genexpression: Entscheidungs-Prozesse bei Zelldifferenzierung können durch feed-back- Mechanismen erreicht werden

REP ORT ER -A SSA Y

 Dient dem Nachweis der Gewebsspezifischen Genexpression

  1. Das Gen für die Elastase (Pankreas-Enzym) der Maus wird isoliert Das Gen für ein humanes Wachstumshormon (gut nachweisbar) wird isoliert
  2. Es wird ein DNA-Konstrukt generiert, bei dem die Kontrollregion der Maus-Elastase vor das Gen für den Wachstumsfaktor geschaltet wird.
  3. Das DNA-Konstrukt wird in eine befruchtete Mäuse-Eizelle eingebracht
  4. Das humane Wachstumshormon wird im Pankreas der Maus hergestellt

 Man weiß, wann und wo die Elastase in der Maus hergestellt wird

METH Y LI ERU N G D ER DN A (F ES TKLOP F EN )

 Zur Fortsetzung der epigenetischen Entscheidungen ( stabile Vererbung ) Die Tochterzellen müssen die Entscheidung stabil fortsetzen können  Gekoppelt an die ReplikationMethylierung führt immer zur Inaktivierung eines Abschnittes

 Methylierungen finden immer nur an Cytosin statt  Cytosin wird nur dann methyliert, wenn es von 5‘ → 3‘ Position ein G in der +1 Region trägt  die Methylierung einer Position des DNA-Doppelstranges bleibt in beiden Matrizensträngen bestehen und wird in der entsprechenden Position des Tochterstranges ergänzt

Unter DNA-Methylierung versteht man die chemische Kopplung von Methylgruppen an bestimmte Nukleotide der DNA. Cytosin kaŶŶ iŶ eiŶer „ŶorŵaleŶ͞ uŶd eiŶer ŵethylierteŶ VersioŶ ǀorliegeŶ, das heißt ŵit eiŶer angehängten Methylgruppe - allerdings nur, wenn direkt darauf die Base Guanin folgt.

Die Konsequenzen der Methylierung zeigen sich bei der Regulierung der Genexpression deutlich: Methylierte Cytosine in der Promotorregion eines Gens führen zu seiner Inaktivierung und agieren somit als „AussĐhalter͞. Dieses Phänomen verhindert, dass alle Gene in einem Gewebe oder einer Zelle gleichzeitig exprimiert werden. Da im Genom alle Cytosine in einem CG-Kontext bekannt sind (also alle Cytosine, die vor einem Guanin liegen), lassen sich sowohl gewebe- als auch krankheitsspezifische Muster identifizieren. Sie ermöglichen die Diagnose von Erkrankungen zu einem sehr frühen Zeitpunkt und erlauben ihre molekulare Klassifizierung

MEC H A N I SMU S DER V ERE RBU N G

Bislang ist es ein großes Rätsel, wie die Tochterzellen nach einer Zellteilung wissen, an welchen Stellen ihrer DNA sie welche Form von Histon-Modifikation initiieren und damit den Histon-Code der Mutterzelle übernehmen sollen.

Hier verläuft es ähnlich wie bei der Modifikation, d. es sind erneut Reader-Writer-Komplexe beteiligt.

Nicht nur die DNA-Stränge müssen dupliziert werden, sondern auch die Nucleosomen müssen dupliziert werden.

 Die elterlichen Nucleosomen werden in jeder 2. Position eingebaut  Problem: In jeder 2. Position gibt es eine Lücke  Lösung: Die Lücke wird im Sinne der epigenetischen Modifikation erneut durch Reader-Writer- Komplexe aufgefüllt

Der Histon Code allein macht noch nichts , soŶderŶ ist eiŶe Art „BarĐode͞ für die BiŶduŶg ǁeiterer interpretatorischer Proteine z. Heterochromatin-Proteine, die den Histon Code dann z. nach außen hin abschirmen, sodass keine Bindung von Transkriptionsfaktoren erfolgen kann.

Wie wird also das Problem der "Verdünnung von vorhandenen Merkmalen" in der Replikation gelöst und somit eine stabile Vererbung der Merkmale eingeleitet?

DNA-Methylierung : Positionsinformationen bleiben erhalten: eine Enzym erkennt die Methylierung im Mutterstrang und ergänzt sie im Tochterstrang

Histon-Code : Die elterlichen Nucleosomen bleiben in jeder zweiten Position erhalten, der Reader- Writer-Komplex füllt dann die Lücken auf

S IGNAL E FÜR DI E Z EL LDIFF ERENZ IERU NG

Woher wissen die Zellen, was sie machen müssen?

BEI SP I EL: GES TREI F TE R MU SKEL I N VER TEBRA TE N (SKEL ETTMU SKU LA TU R)

 Irgendwann müssen die Zellen mal ein Signal erhalten haben sich in diese extrem ausdifferenzierten Skelettmuskelzellen zu entwickeln

 Neralrohr ist typisch für Vertebratenentwicklung

 Dorsal und ventral des Neuralrohrs befinden sich Somiten.

 Diese Somiten enthalten Dermomyotome (Muskelvorläuferzellen)

o mesodermal o Differenzieren sich in Rippenmuskulatur o Zellen können auswandern in periphere Regionen und dort die Muskeln der Extremitäten zu bilden

Pax3 = Transkriptionsfaktor, der die Entscheidung festlegt

VORA U SSETZ U N GEN : G ES TR EI FTE R MU SKE L

 Vorläufer: mesodermale Zellen aus Somiten (Dermomyotome)Schrittweise Entscheidungsfindung bis zur terminaler Differenzierung zu Skelettmuskelzellen  Notwendigkeit der lebenslangen Regeneration (Muskeln können lebenslang regenerieren) -> Stammzell-”pool” muss erhalten bleiben (in der Peripherie der Skelettmuskulatur und bei Verletzung geschädigtes Muskelgewebe ersetzen kann)

SI GN A L Z U R DI FFEREN Z I ERU N G I N SKEL ET TMU S KELZ EL LEN

Masterregulatoren (Oben in der Hierarchie der Entscheidungen) → Homeodomain- Transkriptionsfaktoren o Pax o PaxFrüher Determinierungsfaktor/TS-Faktor (Arbeitet zusammen mit den Homeodomain- Transkriptionsfaktoren) o Mrf

  1. Durch extrazelluläre Signale auf die mesodermalen Vorläuferzellen kommt es zur Produktion von mrf4 (früher Determinierungsfaktor) und Expression von pax3 und pax
  2. In Kombination werden Gewebespezifische Transkriptionsfaktoren wie myoD ausgeschüttet und es kommt zur ersten Differenzierung zu Myoblasten
  3. Wegnahme der Wachstumsfaktoren , damit die gewebespezifischen Transkriptionsfaktoren wirken können und die spezifischen Genprodukte entstehen
  4. Fusion zu Myotubes
  5. Expression von Myogenin und erneute Expression von mrf4 (zentraler Transkriptionsfaktor)
  6. Akkumulation von muskelspezifischen Proteinen und Entstehung der Muskelfaser

TEI LM EC H A N I SMU S Z U R DI FFEREN Z I ERU N G Z UM MU SKE L

Wie wird die Summe der Transkriptionsfaktoren, der zu einer selektiven und effizienten Differenzierung zu Muskelzellen führt hochgefahren?

o Basale Transkriptionsfaktoren ermöglichen das Binden der RNA- Polymerase II an das Zielgen o Im Laufe der Differenzierung wird einer der basalen Transkriptionsfaktoren ausgetauscht gegen zwei muskelspezifische Proteine, die die RNA-Polymerase II aktivieren:

TFIID → TRF3 + TAF

Die muskelspezifischen Proteine erkennen andere Promotorsequenzen als das TFIID der basalen Transkriptionsmaschinerie, sodass nun auch muskelspezifische Genprodukte entstehen können. Die Polymerase II kann nun aktiviert werden und es kommt zu einer hohen Spezifität. Eine Reihe neuer Zielgene kann angesteuert werden.

A U STRI TT A U S D EM Z E L LZ YK LU S Z U R TER MI N A L EN DI FF ERENZ I ERU N G Z U R

DET ERMI N A TION

Entscheidungen des Zellzyklus werden von Cyclin abhängigen Kinasen (Cdks) umgesetzt:

G1-Phase : Aktivität von Cdk4 und Cdk6 , die beide mit dem gleichen Cyklin interagieren können ( D-Typ-Zykline ). Dies ist das Startsignal für den Eintritt in den Zellzyklus

Cdk4/Cdk6 + Cyklin D phosphorylieren ein Tumorsupressorgen ( Retinoblastomaprotein ). In dessen Anwesenheit können Zellen nicht in den Zellzyklus eintreten. Durch die Phosphorylierung wird das Retinoblastomaprotein abgebaut und die Zellteilung somit nicht mehr unterdrückt.

Der Zellzyklus muss stark reguliert werden können! Inhibitionen können erfolgen durch:

o p21 (Tumorsupressorgen) o Myo D (Gewebsspezifischer Transkriptionsfaktor) → Kann über 2 Mechanismen inhibieren:  direkt: direkte Inhibition der Kinaseaktivität des Cdk4/Cdk6 + Cyklin D-Komplexesindirekt sorgt für die Expression von p

Z U SA MMEN FA SSU N G: TERMI N A LE Z EL LDI FFER E N Z I ERU N G

 Terminale Differenzierung geht mit Stopp der Zellproliferation einher  Myogenin und MyoD : Transkriptionsfaktoren von p21 : Inhibitor von Cdk4/6, d. Block des Eintritts in den Zellzyklus!  MyoD ist auch ein direkter Inhibitor von Cdk

ÖRTLI C H E U N D Z EI T LI C H E EI N ORDN U N G D ER

MU SKELDI FF EREN Z I ERU N G

 Aus den Dermomyotomen wandern Muskelvorläuferzellen (Pax3) in die Peripherie um dort die Muskulatur der Gliedmaßen aufzubauen.  Neben Muskelzellen bleiben Stammzellen Satelliten( , Pax7) erhalten, die noch proliferierende Eigenschaften haben.

Auch im adulten Stadium sind die Transkriptionsfaktoren, die eigentlich nur beim Aufbau der Muskeln vor der Geburt beteiligt sind, aktiv. Stichwort adulte Stammzellen und Regeneration.

ZUS AMMENFAS S UNG: MEC HANIS ME N D ER KO NT ROLL E ZUR GE NEXPRES S I ON

Zelldifferenzierung als Summe der Entscheidungen unter Kontrolle der Genexpression, die ein spezifisches Zell-Proteom etabliert.

1. Signale 2. Signaleffektoren 3. Regulation der Genexpression  Epigenetische Faktoren: Voreinstellungen, welche Bereiche werden abgelesen? Welche bleiben inaktiv  Basale Transkriptionsmaschinerie  Regulatorische Transkriptionsfaktoren wirken über den Mediatorkomplex auf die basale Transkriptionsmaschinerie.

4. Genexpression und damit Entstehen eines für eine differenzierte Zelle spezifisches Proteom.

BEI SP I EL S I GNALT RANS DUKT ION D UR CH PHOS PHORYLI ERUN GS KAS KAD E

  1. Es ist kein extrazelluläres Signal vorhanden, das Zielgen im Zellkern wird nicht exprimiert
  2. Ein extrazelluläres Signalprotein wird von dem Rezeptor gebunden
  3. Der Rezeptor durchläuft selbst eine Phosphorylierung (a uto-phosphorolyrende Aktivität oder Dimer-Komplex mit phosphorylierender Aktivität)
  4. Ein weiteres Protein (oft ebenfalls eine Kinase) bindet an den phosphorylierten Rezeptor und wird selbst phosphoryliert
  5. Die phosphorylierte Kinase phosphoryliert wiederum weitere Proteine (Kinase-Kaskade)
  6. Signaltransferierung in den Zellkern
  7. Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors
  8. Zielgen kann abgelesen werden

BEI SP I EL K OMP LE XB ILDU NG

  1. Signalmolekül ist an Membranrezeptor gebunden -> Konformationsänderung
  2. Dadurch wird der Rezeptor aktiv und bewirkt, dass sich ein Transkriptionsfaktor von einem Signalkomplex löst
  3. Transkriptionsfaktor wird in Zellkern transferiert
  4. Genexpression kann stattfinden.

BEI SP I EL PROT EO LYT IS CHE AKT IV IT ÄT

  1. Durch direkten Zell-Zell-Kontakt wird der Rezeptor der Zielzelle mit dem der Signalzelle in Verbindung gebracht
  2. Der Rezeptor durchläuft eine Konformationsänderung
  3. Freisetzung einer Sequenz, die durch eine Protease erkannt wird
  4. Protease spaltet Teil vom Rezeptor ab, eine Proteindomäne wird ins Cytoplasma freigesetzt
  5. Die zytoplasmatische Domäne wird in den Zellkerntransferiert und aktiviert dort den Transkriptionsfaktor
  6. Genexpression kann stattfinden

→ Es gibt auch Mischformen (ist die Regel)

BEI SP I EL SI GN A LKA SKA DE: S ONI C H EDG EHOG ( S HH)

Signal Sonic Hedgehog (Shh) → Führt am Ende zur Stabilisierung des TS- Faktors Gli2, der normalerweise durchgehend abgebaut wird  Rezeptor Patched → Inhibitor von Smoothend, → Bindung von Shh → primäre Funktion: Oxysterol aus der Zel le pumpend damit Oxysterol sich nicht in der Membran anreichert  Membrankomponente Oxysterol → Aktivator von SmoothendMembranprotein Smoothend → Setzt weitere Signale in Gang  Transkriptionsfaktor : Gli2 → Wird gegen Abbau stabilisiert

  1. Bindung von Shh an Patched
  2. Patched kann Oxysterol nicht herauspumpen (inhibiert)
  3. Oxysterol sammelt sich in der Membran an
  4. Durch die Akkumulation von Oxysterol wird Smoothend aktiviert
  5. Smoothend setzt weiter Signale in Gang
  6. Proteolyse des Gli-Komplexes
  7. Stabilisierung von Gli
  8. Gli2 wird in den Kern transferiert und steuert die Transkription der entsprechenden Zielgene an

Dies ist allerdings nur eine schematische Vereinfachung, im Großen und Ganzen ist der Mechanismus nämlich noch komplizierter:

Primäres Zilium  Umgeben von Plasmamembran  Nicht-Motil (Antenne)  9x2 Struktur  Verändert sich bei der Akkumulation von Smoothend

  1. Shh bindet an Patched
  2. Patched wird abgebaut
  3. Aufhebung der Inhibition von Smoothend
  4. Smoothend wird aktiv und akkumuliert im primären Zilium
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VL 3 - Mechanismen der Zelldifferenzierung II, Epigenetik

Kurs: Entwicklungsbiologie/Genetik

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VL 3 – MECHANISMEN DER
ZELLDIFFERENZIERUNG II
Die erste Möglichkeit der Zelldifferenzierung erfolgt durch Transkriptionsfaktoren, posttranslationale
Modifikationen etc. Es gibt allerdings noch ein zweites Prinzip, das unabhängig von der Summe aller
Transkriptionsfaktoren der Zelle existiert.
Es gibt also diese 2 Mechanismen der Genregulation
Summe aller Transkriptionsfaktoren (Masterregulatoren + alles andere)
Epigenetik (DNA- und Histon-Modifikation)
Führt alles zu einem stabilen Genexpressionsmuster
EPIGENETISCHE MECHANISMEN
Hierbei geht es um die Zugänglichkeit der DNA, also der Anordnung des Chromatins. Wenn die DNA gar nicht
zugänglich ist, dann haben auch Transkriptionsfaktoren keinen Einfluss. In verschiedenen Entwicklungsstadien
kann die DNA unterschiedlich zugänglich sein.
DEFINITION EPIGENETIK
“Merkmale, die nicht auf der Primärstruktur der DNA codiert sind, aber weiter vererbt werden“ (Die
Entscheidung muss stabil gemacht werden.)
Modifikationen von
o (1) DNA (Methylierung)
o (2) Histonen (“Histone-Code”)
Bindung von weiteren Proteinen
Bsp.: Bar-Körperchen: durch epigenetik wird das zweite X-Chromosom inaktiviert (Dosage
Compensation)
FEEDBACK-MECHANISMEN
Kontrolle der Genexpression: Entscheidungs-Prozesse bei Zelldifferenzierung können durch feed-back-
Mechanismen erreicht werden
REPORTER-ASSAY
Dient dem Nachweis der Gewebsspezifischen Genexpression

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