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Electroporation DE Clons
Biology (Bio 137)
Long Island University
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ELECTROPORATION
Elle consiste à appliquer de courtes impulsions haute tension à un mélange de cellules hôtes en suspension et de vecteurs recombinants en solution. Ces impulsions augmentent la perméabilité des membranes, permettant aux vecteurs de passer dans la cellule. C'est une méthode très efficace qui peut être appliquéeà tous les types de cellules hôtes.
Sélection et identification de clones recombinants Une fois le processus d'introduction du vecteur terminé,un mélange avec trois types de cellules est obtenu : - Cellules non transformées, n'ayant capturé aucune molécule d'ADN. - Cellules transformées qui portent le vecteur recombinant. - Cellules transformées qui portent un vecteur non recombinant ou une molécule d' ADN indésirable.
Par conséquent, un processus de sélection et d'identification des clonesest nécessaire recombinants, qui seront ceux qui porteront le vecteur recombinant spécifique.
Ce processus de sélection est conditionné par des marqueurs génétiques portés par le vecteur : gènes de résistance aux antibiotiques, enzymes produisant des réactions colorées, protéines fluorescentes, gènes létaux, etc.
C'est l'un des premiers systèmes de sélection et d'identification et repose sur l'utilisation de vecteurs avec deux gènes de résistance aux antibiotiques, généralement l'ampicilline et la tétracycline. Le site d'insertion de l'ADN étranger est à l'intérieur de la séquence d'un des gènes de résistance, de sorte que dans les vecteurs recombinants ce gène n'est pas fonctionnel (sa séquence est interrompue par l'insertion d'ADN étranger).
Lorsque ce vecteur est introduit dans des bactéries sensibles à l'ampicilline et à la tétracycline, on obtient trois types de cellules : - Cellules non transformées avec le vecteur : sensibles aux deux antibiotiques. - Cellules transformées avec le vecteur recombinant : résistantes à l'ampicilline et sensibles à la tétracycline. - Cellules transformées avec le vecteur non recombinant : résistantes aux deux antibiotiques.
Avec ce système, la sélection s'effectue en cultivant les cellules dans un milieu de culture avec de l' ampicilline dans lequel seules les bactéries transformées vont croître. L'identification se fait en répliquant la plaque d'ampicilline sur une autre plaque de tétracycline. Par conséquent, les clones recombinants seront les colonies qui poussent sur la plaque d'ampicilline et ne poussent pas sur celle contenant de la tétracycline.
Protéines fluorescentes Elle repose sur l'utilisation de vecteurs avec un gène de résistance pour la sélection et un gène codant pour une protéine fluorescente pour l'identification. La région polylinker est incluse dans le gène de la protéine fluorescente, de sorte que les inserts inactivent le gène. La protéine la plus utilisée est la GFP, isolée d'une méduse.
Gènes de résistance aux antibiotiques La sélection des bactéries transformées est réalisée par croissance dans des milieux de culture avec des antibiotiques, et l'identification est réalisée en éclairant les plaques de culture avec de la lumière ultraviolette. Les colonies de bactéries transformées avec des plasmides non recombinants présentent une fluorescence verte tandis que celles transformées avec des plasmides recombinants ne seront pas fluorescentes.
Gènes létaux Il s'agit d'une méthodologie relativement récente qui utilisecomme marqueur de sélection la résistance aux antibiotiques, et un gène qui code pour une protéine létale comme marqueur d' identification. Dans les vecteurs recombinants, la protéine létale n'est pas fonctionnelle car ladu séquencegène est interrompue par l'insert d'ADN étranger.
La sélection et l'identification se font simplement en faisant croître les bactéries dans un milieu avec l'antibiotique. Dans ce milieu, seules les bactéries qui portent le vecteur recombinant croissent, car les bactéries non transformées ne croissent pas en raison de la sensibilité à l'antibiotique, et celles transformées avec le vecteur non recombinant meurent sous l'effet de la protéine létale.
BIBLIOTHÈQUES D'ADN UneADN bibliothèque d'est une collection de vecteurs recombinantsclonés dont les séquences d'ADN étrangères ont été obtenuesà partir d'un seul organisme.
Types de bibliothèques d'ADN Les bibliothèques d'ADN peuvent être de trois types selon l'origine de l'ADN cloné.
Bibliothèques génomiques Ce sont des collections de vecteurs recombinants clonés qui incluent l'intégralité du génome d'un organisme. Des vecteurs de grande capacité sont souvent utilisés pour essayer de contenir le génome entier dans le moins de clones possible. Plus précisément, ils sont généralement effectués sur des phages, des cosmides, du BAC ou du YAC. En théorie, une banque génomique doit contenir au moins une copie de toute séquence présente dans le génome d'un organisme. Le nombre minimum de clones nécessaire pour que cette condition soit remplie peut être calculé en fonction de la taille du
Electroporation DE Clons
Course: Biology (Bio 137)
University: Long Island University
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