Información
Chat IA

Esto es un Documento Premium. Algunos documentos de Studocu son Premium. Conviértete en Premium para desbloquearlo.

Práctica 6. Aislamiento de plásmido y Digestión con enzimas de restricción

Materia

Bioquímica Experimental (Bio0141)

86 Documentos

Los estudiantes compartieron 86 documentos en este curso

Universidad

Universidad Nacional Autónoma de México

Año académico: 2017/2018

Subido por:

Jessica Gutiérrez

Universidad Nacional Autónoma de México

0seguidores

13Archivos subidos

999+upvotes

Comentarios

Inicia sesión (Iniciar sesión) o regístrate (Registrarse) para publicar comentarios.

Otros estudiantes también vieron

Otros documentos relacionados

Studylists relacionadas

Quiybio bioquímica

Vista previa del texto

Facultad de Grupo 6 Optativa Disciplinaria Tipo: Experimental 6 Edificio B Lun p. y Mie p. Profesores: Dr. Euclides y Dra. Carmen Adriana Mendoza y ensayo de del recombinante en transformantes de E. coli BL21 (DE3) Por: Silvestre Jessica Iturbide Carrasco Mote Leonardo Depto. Facultad de UNAM. Circuito Exterior Copilco El Bajo, Cd. Universitaria. 04510 Ciudad de CDMX. Correo de correspondencia: RESUMEN Se el de lisis alcalina, donde se lisan las membranas de las mediante un detergente SDS y un choque alcalino con NaOH y se precipita el recombinante con isopropanol, para luego digerirlo con enzimas de BamHI y NdeI debido a que el vector utilizado en la tiene dos sitios de para enzimas diferentes de manera que cortando con estas dos enzimas se libera el fragmento de se a cargar en un gel de agarosa al con EtBr y se con respecto a un marcador de molecular del lambda digerido con En los resultados se muestran 3 carriles con diferentes pesos moleculares, correspondientes a: el p., otro fragmento con peso molecular que corresponde al digerido con las 2 enzimas de p. y un fragmento de peso molecular de p. (inserto). Palabras clave: de provenientes de Eubacterias y Arqueas. BamHI: enzima de descubierta en Bacillus amyloliquefaciens. NdeI: enzima de aislada de Neisseria denitrificans. p.: pares de bases. Los son de ADN circular que se replican de manera en procariontes. Debido a su capacidad de replicarse se utilizan como vectores de de genes de el cual se pueden insertar u obtener utilizando enzimas de (usualmente las de tipo II). Para asegurar que las bacterias transformadas poseen el vector recombinante con la secuencia de se utiliza una de monitoreo aislamiento de y (0141) EXPERIMENTAL 2 El tratamiento de una de DNA con enzimas de permite producir fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. Facultad de de la UNAM. No. de Previamente se inoculando una colonia de las transformadas obtenidas anteriormente en medio Luria resistentes a kanamicina, un buen crecimiento. Se la del DNA de la bacteria E. coli BL21 transformante. Si las de E. coli transformantes adquirieron el entonces se que una vez separado del DNA mediante el de lisis alcalina se dicho mismo, una vez tratado con las enzimas de NdeI y BamHI se observar diferentes bandas en un gel de agarosa debido a los cortes de RESULTADOS Se utilizaron dos enzimas de NdeI y BamHI, al RNasa se el RNA, facilitando la de los productos de la en el gel, lo siguiente: OBJETIVOS Realizar la del ADN mediante el de Lisis alcalina. Cortar el aislado con enzimas de NdeI y BamHI y visualizar los productos de la en un gel de agarosa. Determinar el de fragmentos de nucleicos. MATERIALES Y Material transformantes de E. coli obtenidos en la Se el de las enzimas de BamHI y NdeI. El desarrollo experimental se a cabo siguiendo las instrucciones del manual de Experimental. 2013 de la Figura 1. Resultado de una electroforesis horizontal de DNA de E. coli BL21 (DE3) en gel de agarosa al con Bromuro de Etidio. Se muestra el marcador molecular con el peso correspondiente a cada banda, de igual forma se observa el corrimiento de los tubos T2, T1 y T3. (0141) EXPERIMENTAL celular y la de DNA y DNA se vio menos afectado por su y estructura superenrollada lo que le salir a de los hoyos de la membrana celular. La del medio con la sal Acetato de potasio, la de las (por el tratamiento con el detergente), la insolubilidad de la sal del dodecil sulfato, como la del ADN Estos agregados insolubles se separaron del ADN por quedando el en el sobrenadante. Al sobrenadante obtenido (donde hay ADN se le isopropanol, cuyo efecto la del Posteriormente, para asegurar la del ADN se le etanol al 70 con el objetivo de que los contaminantes se disolvieran en el agua y separarse del ya que las sales en altas concentraciones inhiben la de las enzimas de NdeI y BamHI. Finalmente, el ADN se en agua para su en el ensayo de En soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo estas migran hacia el electrodo positivo Cuando la ocurre, las de DNA se separan de acuerdo a su y aquellos fragmentos se mueven a del poro del gel que los grandes y dependiendo de la del este puede migrar de manera diferente 4 en un campo a pesar de tener el mismo peso molecular. Cuando los fragmentos se han separado, al sumergir el gel en una que contiene bromuro de etidio plana con afinidad por el ADN que se intercala entre los pares de bases y que tiene la particularidad de que fluoresce cuando unido a al iluminar con luz U. se ven bandas de fluorescencia que corresponden a fragmentos de ADN. Para el de las muestras de ADN digeridos con las enzimas BamHI y NdeI y el sin digerir fueron cargados en los pozos en un gel de agarosa al con un marcador de molecular obtenido del lambda que fue digerido con El al poseer sitios al realizarse el corte con las enzimas antes mencionadas produjo los fragmentos de DNA que se observan en los carriles T1 y T3 de la figura 1. Se muestra en el carril T2 las diferentes conformaciones del sin digerir en la que se observa que el superenrrollado un mayor camino en el gel. El de las bandas producido por cada enzima de se hace visible por la de las bandas con un reactivo como el bromuro de etidio que se intercala en el ADN. mismo, en la figura 1 los fragmentos se logran observar en el carril marcado como T3 ya que en este se la muestra con ambas enzimas causando que el se dividiera en fragmentos con a aquellos en donde solo se una sola enzima, o bien, ninguna. Con respecto, al carril T2 se ven pocas bandas, esto porque el al no ser digerido con ninguna enzima 5 SJ y cols. y ensayo de del recombinante. se encuentra intacto. Finalmente, en el caso de T1 se observa una banda con menor peso molecular que la del sin digerir pero mayor al del digerido con las 2 enzimas, debido a que en este carril solo se una enzima, BamHI. CONCLUSIONES Se que las de E. coli transformantes adquirieron el Luego de digerir el con BamHI y NdeI se pudo observar en el gel de agarosa una de ADN de aproximadamente 1284 p. de acuerdo al marcador utilizado, por lo que se trata del transgene REFERENCIAS Et Al. Manual de de laboratorio: de Molecular. UAM. Unidad Iztapalapa. de Ciencias y de la Salud. 2013. CDMX. No. consultadas: 27. Nieto, Sobeida. Material de apoyo para los estudiantes del curso Experimental (0141). Departamento de Facultad de 2013. CDMX. No. consultadas: Nieto, Et Al. Manual de de Experimental (0141). Departamento de Facultad de 2013. CDMX. No. consultadas: Soto C. Et Al. Manual de de Molecular. MVZ. UNAM. Departamento de Ciencias de Ciencias Agropecuarias. 2016. CDMX. No. consultadas: 11, 25, 28, 32. Nelson DL, Cox MM. Principios de 3ra. 2001. Editorial Omega. Barcelona, No. consultadas: Stryer L., Berg J., Tymoczko J. 5ta. 2003. Editorial Barcelona, No. consultadas: del ADN recombinante. Consultado el 28 de octubre de 2017. Disponible en: Las enzimas de las de los ingenieros Consultado el 28 de octubre de 2017. Disponible en: Protocolo que al Prep Miniprep Laboratorio Virtual de Molecular del Departamento de y Molecular. Universidad de Madrid, Disponible en:

¿Ha sido útil este documento?

Premium

Esto es un Documento Premium. Algunos documentos de Studocu son Premium. Conviértete en Premium para desbloquearlo.

Práctica 6. Aislamiento de plásmido y Digestión con enzimas de restricción

Materia: Bioquímica Experimental (Bio0141)

86 Documentos

Los estudiantes compartieron 86 documentos en este curso

Universidad: Universidad Nacional Autónoma de México

¿Ha sido útil este documento?

Esta es una vista previa

¿Quieres acceso completo? Hazte Premium y desbloquea todas las 6 páginas

Accede a todos los documentos
Consigue descargas ilimitadas
Mejora tus calificaciones

Subir

Comparte tus documentos para desbloquear

¿Ya eres premium?

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN

circular que se replican de manera autónoma en

procariontes. Debido a su capacidad de

replicarse rápidamente, se utilizan como

vectores de clonación de genes de interés, el cual

se pueden insertar u obtener utilizando enzimas

de restricción (usualmente las de tipo II). Para

asegurar que las bacterias transformadas poseen

el vector recombinante con la secuencia de

interés se utiliza una técnica de monitoreo

genotípico: aislamiento de plásmido y

0141-Bioquímica Experimental________ Facultad de Química

Grupo 6 ● Ago-Nov (2018-1) ● Optativa Disciplinaria

Tipo: Experimental ● 6 créditos L-307 / Edificio B

● Lun 4:00-6:00 p.m. y Mie 4:00-8:00 p.m.

Profesores: Dr. Euclides Ávila Chávez y Dra. Carmen Adriana Mendoza Rodríguez

Purificación y ensayo de restricción del plásmido recombinante

pET-TEM1-ompAβ-lactamasa

en células transformantes de E. coli BL21 (DE3)

Por: Gutiérrez Silvestre Jessica / Durán Iturbide Noemí Ángeles / Carrasco Mote Leonardo

Depto. Bioquímica, Facultad de Química, UNAM.

Circuito Exterior S/N, Copilco El Bajo, Cd. Universitaria. 04510 Coyoacán, México, Ciudad de México, CDMX.

Correo de correspondencia: jessi.g.silvestre@comunidad.unam.mx

RESUMEN

Se empleó el método de lisis alcalina, donde se lisan las membranas de las células mediante un

detergente SDS y un choque alcalino con NaOH y se precipita el plásmido recombinante con

isopropanol, para luego digerirlo con enzimas de restricción BamHI y NdeI debido a que el vector

utilizado en la transformación tiene dos sitios de restricción para enzimas diferentes de manera que

cortando con estas dos enzimas se libera sólo el fragmento de interés; se procedió a cargar en un gel de

agarosa al 1% teñido con EtBr y se observó con respecto a un marcador de tamaño molecular del

bacteriófago lambda digerido con HindIII. En los resultados se muestran 3 carriles con diferentes pesos

moleculares, correspondientes a: el plásmido híbrido~6456 p.b., otro fragmento con peso molecular

que corresponde al plásmido digerido con las 2 enzimas de ~5370 p.b. y un fragmento de peso

molecular de ~1284 p.b. (inserto).

Palabras clave: Endonucleasas-enzimas de restricción provenientes de Eubacterias y Arqueas.

BamHI: enzima de restricción descubierta en Bacillus amyloliquefaciens. NdeI: enzima de restricción

aislada de Neisseria denitrificans. p.b.: pares de bases.

¿Por qué está desenfocada esta página?

Es un documento Premium. Hazte Premium para leer todo el documento.

¿Por qué está desenfocada esta página?

Es un documento Premium. Hazte Premium para leer todo el documento.