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La mitose - Cours magistral dispensé en licence biologie.
Biologie cellulaire
Université Catholique de Lille
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La mitose I. Le cahier des charges pour une ségrégation cellulaire correcte La ségrégation correcte des chromosomes est réalisée grâce à cinq étapes : - La prophase : Condensation et individualisation des chromosomes (déjà dupliqués) - La pro-métaphase et la métaphase : Attachement bipolaire des chromosomes - La transition métaphase-anaphase : Destruction des cohésines - L'anaphase : Séparation des chromatides soeurs - La télophase et la cytodiérèse : Formation de deux cellules filles Les chromosomes ne sont condensés et individualisé que pendant la mitose. Durant l'interphase, ils sont décondensés et à l'état de chromatine. Les chromosomes se condensent durant la prophase et s'organisent en deux chromatides soeurs reliées au niveau du centromère. Durant la métaphase, ils s'accrochent aux fuseau mitotique de façon bipolaire c'est à dire que chaque chromatide du chromosome doit être attachée à un pôle différent du fuseau mitotique. Le fuseau applique une tension sur les deux chromatides qui ne restent attachées entre elles que grâce aux cohésines. Au moment où les cohésines sont rompues, les chromatides se dirigent très rapidement vers les deux pôles du fuseau. C'est le complexe MPF qui permet d'installer la cellule dans l'état mitotique grâce à plusieurs phosphorylations activatrices ou inhibitrices. Les protéines cibles de MPF possèdent une séquence consensus particulière "S/T-P-X-K/R". La mitose est un processus bien connu car il a été étudié depuis longtemps. Sa première description était en 1882. Remarque : L'immunofluorescence permet de voir les chromosomes colorés au dapi (en bleu) et le fuseau mitotique grâce au tubuline colorée en vert. II. Prophase : Installation de l'état mitotique Remarque : Toutes les étapes de la prophase se font simultanément, mais on les verra une par une, dans un soucis de compréhension. 1. La condensation des chromosomes La prophase est la phase où l'activité de MPF explose. Dès la fin de G2, tous les chromosomes ont deux chromatides (grâce à la réplication durant la phase S) qui sont attachées par des cohésines. Durant la prophase, il y a condensation et raccourcissement des chromosomes. A la fin de la prophase, les chromosomes forment un complexe appelé complexe centromère kinétochore (C-K). Pour pouvoir avoir une ségrégation correcte, il faut que les chromosomes soient en condensation maximale tout en conservant l'intégralité de la molécule d'ADN intacte. En effet, celle ci ne doit pas se casser donc il faut une réorganisation des chromosomes avant la condensation. MPF phosphoryle les histones, notamment H1, et les HMG, ce qui permet une réorganisation de la structure des nucléosomes et une compaction des ceux ci. Les chromosomes vont pouvoir se compacter sans se casser. MPF phosphoryle également les condensines pour pouvoir condenser les chromosomes. Les condensines ont une structure très proche des cohésines. Elle est constituée de sous unités Smc (Structural maintenance of chromosome), Smc2 et Smc4, qui ensemble forment un anneau autour de l'ADN. Ces deux sous unités interagissent au niveau d'une "charnière". Elle a également des complexes de régulation de condensines (CAP) et un domaine ATPase. La condensine va emprisonner plusieurs boucles d'ADN et ainsi permettre la condensation des chromosomes. Elle ne joue un rôle que durant la mitose. Avant celle ci, elle se trouve en effet dans le cytoplasme et ne peux donc pas agir avec l'ADN. Au début de la mitose, lorsque MPF est activé, il phosphoryle la condensine au niveau de son domaine ATPase. Cela provoque un changement de conformation de la condensine et un démasquage du signal d'entrée nucléaire (NLS). Elle peut ainsi être importée dans le noyau et interagir avec l'ADN. Le processus de raccourcissement est géré par les cohésines. Il y a une cohésine tous les 10 000 paires de bases environs. Celles ci vont se rassembler deux par deux et raccourcir la longueur du chromosome. Il y a donc formation de plusieurs longues boucles d'ADN. La condensation est gérée par les condensines : Les condensines s'attachent au niveau de ces boucles et forment d'autres boucles plus serrées. Remarque : Le mutant gluon a une sous unité smc4 non fonctionnelle et les condensines ne peuvent pas se fermer. Cela provoque un certain nombre de cassure de l'ADN mais n'empêche pas la mitose de continuer. 2. Equipement des centromères-kinétochores La constriction primaire du chromosome marque l'emplacement du complexe centromèreskinétochores (C-K). Cet emplacement n'est pas fixe d'un chromosome à l'autre. Autour de cette constriction primaire, le bras court est appelé "bras p" et le bras long est appelé "bras q". Lorsque le complexe centromère-kinétochore se retrouve au centre du chromosome (et donc que les bras p et q sont de tailles similaires), le chromosome est dit métacentrique. La constriction primaire est unique et présente chez tous les chromosomes. En fonction des chromosomes, on peut aussi trouver une constriction secondaire sur chaque chromatide. Cette constriction secondaire marque l'emplacement de l'organisateur nucléolaire. C'est la région où se trouve les gènes codant pour les ARN ribosomiques 18S, 28S, 58S. Dans le génome humain, cette constriction existe sur les chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22. L'ADN centromèrique humain est de taille variable selon les chromosomes (de 1 à 10 millions de paires de bases). C'est une région marquée par la présence de l'ADN α qui est présent dans tous les centromères et représente ainsi 5% du génome. Cet ADN est indispensable pour pouvoir former le complexe centromère-kinétochore. Il est composé d'un motif répété de 171 paires de bases dont une séquence particulière appelée "CENP-B box" de 17 pb. Cette "CENP-B box" permet le recrutement de protéines centromériques, les CENP, qui forme avec l'ADN centrométique le complexe kinétochore. Pour que cette interaction soit fait correctement, il faut une réorganisation. La protéine CENP-B possède deux domaines de dimérisation du coté C terminal. Ces domaines permettent une homodimérisation c'est à dire l'association de deux CENP-B ensemble. De l'autre coté, elle possède un domaine appelé CENP-B box qui permet son attachement à l'ADN centromérique. Grâce à l'homodimérisation, il y a une double accroches à l'ADN au niveau de deux endroits différents de l'ADN et un rapprochement des deux segments. Il existe une très large variété de CENP qui ont une structure et une fonction différentes. Les CENP les plus importantes pour la mitose sont la CENP-B qui permet de structuré l'ADN centromérique, la CENP-E qui est un moteur moléculaire de l'anaphase et l'INCENP qui sert de repère à la fin de la mitose. Mad et Bub sont des protéines du check-point mitotiques qui contrôle la fin de la mitose. En vert c'est les plus importantes. Remarque : En vert, ce sont les protéines les plus importantes. Après cette première ligne, il y aura polymérisation : les hétérodimères de tubulines s'incorporent au microtubules, les uns derrières les autres. Les ɣ Turc sont incrustés dans la matrice péri centriolaire. En fonction de la richesse en ɣ-TuRC, on peut faire un certain nombre de microtubule en même temps. Les microtubules ont tous la même origine, au niveau du centrosome, mais ils vont irradier dans toutes les directions et couvrir toute la cellule. Un microtubule a un pôle + et un pôle -. Le pôle + est le pôle par lequel le microtubule s'allonge alors que le pôle - est le pôle par lequel le microtubule se raccourcit. Néanmoins, cela est vrai in vitro, car dans ces conditions les deux extrémités sont libres. In vivo, l'une des extrémités est attachée à la protéine ɣ-tubuline dans le MTOC et l'autre extrémité doit assurer l'allongement ou le raccourcissement selon les besoins de la cellule. Un microtubule va alterner les phases d'élongation et de raccourcissement en fonction des besoins. Durant les périodes d'élongation, une coiffe GTP protège le microtubule du raccourcissement en le stabilisant. Cette coiffe est du au fait que la polymérisation est plus rapide que la déphosphorylation du GTP des tubulines. En interphase, la production basale de microtubules correspond aux besoins de la cellule mais ce n'est plus le cas lors de la mitose. De ce fait, il y a mise en place de stratégies d'augmentation de capacité de formation de microtubules dans la cellule mitotique. Sur les microtubules, vont interagir un certain nombre de protéines que l'on appelle les "MAP" : - Les MAPs structurale qui organisent les microtubules et gèrent la polymérisation et la dépolymérisation. Elles se fixent sur un côté pour favoriser l'un ou l'autre. - Les MAPs motrice (ou moteur moléculaire) qui ont la capacité de se déplacer / de "marcher" le long du microtubule qu'elles utilisent comme support. Elles sont composées de deux têtes, de chaines lourdes et de chaines légères ainsi qu'un domaine de liaison vésiculaire. Il existe deux grand types de moteurs moléculaires : o Les kinésines qui une longue chaine lourde et qui marche vers l'extrémité + o Les dynéines qui ont un gros domaine de charge / cargot et marche vers l'extrémité -. Les kinésines sont appelées des moteurs "+" et les dynéines sont appelées des moteurs "-". Dans un contexte interphasique, elles vont permettre de transporter des vésicules contenants toutes sortes de molécules. Dans contexte mitotiques, il n'y a plus du tout de transport vésiculaires et celles transportant des vésicules vont être désactivées. D'autres vont servir au processus de mitose. Remarque : Les résultats obtenus sur la photographie sont possibles grâce à une immunofluorescence. On utilise un anticorps anti α-tubuline (qui se colore en vert à cause de l'interaction) et un anticorps anti ɣ-tubuline (qui se colore en rouge à cause de l'interaction). 4. Mise en place du fuseau mitotique Durant l'interphase, tous les microtubules sont formés dans le centrosomes et irradies dans toutes la cellule. Leur extrémité + sont en périphérie et leur extrémité - attaché au niveau du centrosome. La duplication des centrioles est réalisé durant la phase S donc il y a deux centrosomes dans la cellule en mitose. Ces deux centrosomes restent à proximité immédiate l'un de l'autre au début de la mitose puis il y a une réorganisation complète du système tubulaire et les deux centrosomes vont migrer vers les deux pôles de la cellule. Pour cela, le MPF phosphoryle un certain nombre de MAP structurales et motrices. La phosphorylation des MAPs structurales permet de favoriser la dépolarisation des microtubules. On dit que l'environnement est déstabilisateur des microtubules et que les microtubules ont un comportement extrêmement dynamique. Les microtubules sont alors relativement courts. Toutes les protéines qui transportent des vésicules sont phosphorylées et inhibées car elles ne sont pas utiles lors de la mitose. Il y a aussi phosphorylation activatrice de MAPs motrices utiles pour la mitose et qui sont dans un état inactif durant l'interphase. C'est le cas de Eg5 qui est un moteur moléculaire de type kinésine c'est à dire se déplaçant vers l'extrémité +. Cette kinésine est spéciale car elle à 4 têtes (deux de chaque côté). Elle n'a donc pas la possibilité d'être chargée. Par contre, chaque paire de tête peut interagir avec un microtubule différent et se déplacer dessus. Elle va s'accrocher à deux microtubules provenant chacun d'un centrosomes différent. Elle doit ensuite se déplacer vers le pôle + sur les deux microtubules en même temps, alors qu'ils ont une orientation inverse. Elle fait donc du sur place et est immobile mais l'énergie mécanique qu'elle dégage pour se déplacer va provoquer le mouvement des microtubules. Il y a ainsi glissement des microtubules et les deux centrosomes s'éloignent de plus en plus. De plus, il y a polymérisation progressivement des microtubules pendant qu'elle marche, se qui permet l'éloignement progressif des deux centrosomes jusqu'à se qui soient aux deux pôles de la cellule et du futur fuseau mitotique. Ce mouvement est accéléré par un autre moteur moléculaire, de type dynéine. Elle va interagir avec un complexe de dynactine qui est en interaction avec la membrane plasmique de la cellule. La dynéine est fixée sur ce complexe au niveau de son domaine de liaison vésiculaire et est fixé au microtubule au niveau de sa tête. Elle se déplace vers le pôle "-" mais, comme elle est attachée à la membrane, elle fait du surplace et cela provoque le déplacement des microtubules vers la membrane de la cellule. L'éloignement des centrosomes est ainsi plus rapide du fait du rapprochement des centrosomes et des dynéines fixées à la membrane plasmique. Ces mouvements se font jusqu'à ce que les centrosomes soient diamétralement opposés dans la cellule. Il y aura un contrôle après cette étape pour vérifier que les forces sont équilibrées et donc que le fuseau est centré. L'équateur du fuseau mitotique se trouve exactement au niveau de l'équateur de la cellule. Cela est très important pour la fin de la mitose. Le glissement doit s'arrêter lorsque le fuseau se trouve à sa position définitive. Le blocage se fait notamment grâce à Ase1 qui va interagir avec Eg 5 pour former le complexe Ase1/Eg5. Eg5 est alors inhiber et son mouvement bloqué. Dans la cellule mitotique, il y a deux types de microtubules : - Les microtubules polaires qui irradient vers le centre de la cellule et donc vers le noyau - Les microtubules astraux (ou astériens) qui irradient vers la membrane / en périphérie Remarque : Durant ce stade de la prophase, l'enveloppe nucléaire est toujours intacte 5. Augmentation de la capacité de nucléation des microtubules L'augmentation de la capacité de nucléation se fait grâce au recrutement d'ɣ-TuRC supplémentaires au niveau des centrosomes. La cellule possède une réserve de ɣ-tubuline extra-centrosomique qui se trouvent dans tous le cytoplasme durant l'interphase. Ces ɣ-TuRC cytoplasmique sont appelées ɣTuSC (small complexe) lorsqu'elles se trouvent dans le cytoplasme et qu'elles sont non fonctionnelles. Durant la prophase, il y a recrutement puis activation de ces ɣ-TuSC au niveau des deux centrosomes. Cela permet d'augmenter la capacité de nucléation du centrosome. Il y aura un grand nombre de microtubules qui seront polymérisés en même temps. 6. Rupture de l'enveloppe nucléaire (NEB) La rupture de l'enveloppe nucléaire est une étape qui arrive seulement à la fin de la prophase. Elle est sous l'influence de MPF. En effet, celui ci phosphoryle les lamines, se qui provoque leur - - - La myosine II qui est un moteur moléculaire des microfilaments. La phosphorylation permet de mettre fin à son interaction avec les microfilaments. Elle ne peut pas former l'anneau contractile qui doit être active durant la cytodiérèse. La phosphorylation est une sécurité pour ne pas former l'anneau contractile avant la bonne phase. Les protéines membranaires et les protéines Rab, permettant une vésicularisation des compartiments et de la membrane nucléaire, ainsi que l'inhibition de la fusion membranaire. Le noyau est donc détruit. Les ARN polymérases et le facteur eEF1a, permettant d'inhiber la transcription et la traduction. En effet, il n'y a plus aucune activité transcriptionnelle dans une cellule en mitose car ce n'est pas utile. De plus, l'ADN n'est pas accessible car il est trop condensé. III. Pro-métaphase : Capture des chromosomes par les microtubules 1. Activité Ran-GTP Le facteur le plus important durant la pro-métaphase est une protéine G appelée Ran. Celle ci est activée par une protéine GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) appelée Rcc1. Son activation se fait grâce au remplacement du GDP par une molécule de GTP. Ran est inactivé par déphosphorylation grâce à une protéine GAP (GTPase Activating Protein) appelée Ran-GAP. Dans une cellule interphasique, Rcc1 est une protéine nucléaire alors que Ran-GAP est une protéine cytoplasmique. De ce fait, durant l'interphase, Ran est active dans le noyau et inactive dans le cytoplasme. De plus, il y a un inhibiteur cytoplasmique supplémentaire, GDI (GDP Dissociation Inhibitor), dans le cytoplasme. Durant l'interphase, Ran permet régulation du transport nucléo-cytoplasmique. En effet, toutes les protéines sont synthétisées dans le cytoplasme mais les protéines nucléaires doivent ensuite être importé dans le noyau. Ces protéines ont une séquence particulière, la séquence NLS, qui permet de les distinguer des autres protéines et d'être reconnu par des importines. Les importines forment un complexe avec la protéine nucléaire, ce qui permet son importation dans le noyau. Une fois dans le noyau, il faut que la protéine soit libérée du complexe pour qu'elle puisse être fonctionnelle. Ran-GTP a comme rôle la dissociation des importines et de la protéine nucléaire. Elle intervient aussi dans le renvoie des importines vers le cytoplasme en se liant à l'importine. Une fois dans le cytoplasme, elle libère l'importine de par son inactivation. De par ces deux actions, on comprend qu'elle ne doit être active que dans le noyau. Dans une cellule mitotique, il n'y a plus de noyau. Un gradient de Ran-GTP se créé alors dans la cellule. La position de l'ancien noyau correspond au lieu avec la plus forte concentration en Ran-GTP. C'est à cet endroit que se trouve les chromosomes. Plus on s'éloigne des chromosomes, plus Ran est inactive car on a une faible concentration de Rcc1. Autour des chromosomes, on a une zone enrichie en Ran active. Cette zone est appelée zone péri-chromatidienne. Tous les constituants (protéine nucléaire, importines α et β) sont libres dans le cytoplasme et répartie uniformément. Il y a donc interaction entre les partenaires. La libération de Ran active permet d'inhiber ces interactions, qui n'ont plus lieu d'être puisque le noyau n'existe plus. Néanmoins, ce processus n'intervient qu'à proximité immédiate des chromosomes puisque c'est à cet endroit que l'on trouve Ran actif. L'inhibition de l'interaction entre les protéines et les importines permet l'activation des protéines nucléaires libérées. Parmi ces protéines nucléaires, deux protéines ont un rôle important : - NuMA qui est impliquée dans l'épissage alternatif des ARN pré-messager durant l'interphase. Pendant la mitose, elle assure un rôle dans l'organisation et la focalisation des pôles du fuseau - TPX2 qui intervient dans l'organisation chromosomique durant l'interphase. Pendant la mitose, il est essentiel pour recruter un ensemble de protéines cytoplasmiques autour des chromosomes qui sont impliquées dans l'effet chromatine. 2. Augmentation de la capacité de nucléation des microtubules La protéine NuMA (Nuclear protein associate with Mitotic Apparatus), aussi appelée centrophiline, assure le maintien des microtubules acentriolaires et la focalisation du fuseau mitotique. A proximité des centrosomes, on trouve une protéine appelée katanine qui permet de couper les microtubules juste après la ɣ-TURC. Les ɣ-TuRC peuvent initier la formation d'un nouveau microtubule. Le microtubule libéré a donc sa partie "-" libre et, sans régulation, il y aurait dépolymérisation rapide de celui ci. Des protéines MAP vont se placer au niveau de l'extrémité "-" et stabiliser le microtubule. La protéine NuMA, ayant une structure symétrique en forme de V, elle va pouvoir interagir avec deux microtubules en même temps (par le biais de son interaction avec des dynéines). Son rôle est de maintenir le fuseau mitotique en place, c'est à dire de garder les microtubules libres à proximité du centrosome, en les rattachant aux microtubules non libres. Elle a également comme rôle de maintenir la focalisation du fuseau, c'est à dire de conserver l'organisation de la forme en entonnoir du centrosome. Le pôle du fuseau doit en effet avoir une certaine dimension, pour qu'il puisse y avoir rassemblement de tous les chromosomes au même endroit et reformation du futur noyau. Si il a une taille trop importante, il y a dispersion des chromosomes aux pôles et formation de plusieurs micronoyaux. C'est une situation létale pour la cellule 3. L'effet chromatine L'effet chromatine est un ensemble de processus qui sont facilité au niveau des chromosomes notamment de par les protéines activent qui les entourent. A proximité immédiate des chromosomes, la concentration de Ran active est forte. Cela permet notamment la libération de la protéine TPX2, qui permet le recrutement d'un certain nombre de protéines permettant de créer localement un environnement favorable à la nucléation et la polymérisation de microtubules. Il y a ainsi, près des chromosomes, nucléation de microtubules non centrosomiques et donc augmentation du nombre de microtubules. Il y a facilitation de la capture des chromosomes sur le fuseau mitotique (de par l'augmentation de la probabilité de rencontre). Les microtubules créés au niveau des chromosomes sont appelés microtubules acentriolaires (ou acentrosomaux). Les chromokinésines sont des moteurs moléculaires de type kinésine (se déplacent vers le pôle "+") qui sont recrutées par TPX2. Les têtes de la kinésines s'associent au microtubule et l'autre extrémité s'associe au chromosome. Parmi ces chromokénésines, Xkid a pour rôle d'éloigner les chromosomes de l'extrémité "-" des microtubules acentriolaires. L'extrémité "-" va donc se rapprocher des pôles du fuseau mitotique. Au niveau du pôle, les chromosomes acentriolaire arrivent et s'intègrent au reste du fuseau grâce aux protéines NuMa et aux dynéines cytoplasmiques. Ces nouveaux 5. Rassemblement des chromosomes en plaque équatoriale Il y a trois types de microtubules : - Les microtubules astraux (ou astériens) qui irradient vers la périphérie / vers la membrane - Les microtubules polaires qui irradient vers le centre de la cellule mais ne sont pas attachés aux chromosomes - Les microtubules kinétochoriens qui irradient vers le centre de la cellule et sont liés directement avec le complexe centromère-kinétochore. Ces microtubules kinétochoriens ont deux rôles importants, l'attachement des chromosomes sur le fuseau mitotique et l'application d'une force de tension sur les chromosomes. A la fin de l'attachement bipolaire, les deux pôles exercent une tension équivalente sur les chromosomes. Pour équilibrer ces forces de tension, le chromosome va naturellement se mettre au centre du fuseau mitotique. Tous les chromosomes auront une position médiane par rapport au fuseau et seront sous tension mécaniques. Cette médiane est appelée plaque équatoriale. Les cohésines, qui se trouvent au niveau du complexe centromère-kinétochore, constituent le seule élément qui permet de garder les deux chromatides soeurs attachées entre elles. C'est la seule contre force (ou contre tension). IV. Métaphase : Vérification de l'attachement bipolaire complet 1. Paramètres vérifiés La métaphase est une phase de vérification de l'attachement bipolaires des chromosomes. Il y a deux critères à vérifier : l'attachement de tous les chromosomes par les microtubules et la tension exercée sur ceux ci. Il faut, en effet, que les deux chromatides aillent dans des directions opposées lors de la future rupture des cohésines et que le fuseau soit fonctionnelle (c'est à dire capable d'assurer cette séparation). De ce fait, il faut qu'un point de contrôle (ou check point) intervienne à ce stade du cycle cellulaire. Les kinétochores sont les sites stratégiques de la surveillance. Il faut que les deux paramètres soit vérifiés puis validés pour pouvoir continuer le cycle cellulaire. 2. Le point de contrôle mitotique La mise en évidence de ce check point s'est fait grâce à trois expériences : - Expérience 1 : On mesure la durée des étapes de la mitose sur différentes cellules en culture. On remarque que la durée de la pro-métaphase est extrêmement variable contrairement à la métaphase qui dure toujours 15 minutes. - Expérience 2 : On ajoute du nocodazole (ou taxol) qui est une molécule dépolarisante des microtubules. Il n'y a donc plus de fuseau mitotique. Cela a pour effet le blocage complet de la mitose en métaphase. - Expérience 3 : La destruction de la fibre kinétochorienne par une micro-aiguille bloque le passage en anaphase (check point actif). La traction à l'aide de la micro-aiguille (pour remplacer le rôle des microtubules) permet le passage en anaphase (check point désactivé). Le point de contrôle surveille l'état et l'organisation fonctionnelle du fuseau mitotique et vérifie que tous les chromosomes sont bien en attachement bipolaire. Ce point de contrôle est appelé SAC, pour Spindle Assembly Check-point. Tant qu'un kinétochore est libre (pas de tension sur celui ci) et que tous les chromosomes ne sont pas attachés, la cellule détecte une anomalie, un signal inhibiteur est émis, ce qui alerte le point de contrôle et la mitose est bloquée. Dès que tous les chromosomes sont attachés (tension sur tous les kinétochores), il n'y a plus de signal inhibiteur et le point de contrôle est désactivé. La mitose est débloquée et le passage à la phase suivante est possible. C'est au niveau des kinétochores que s'exerce principalement ce point de contrôle. Le check point mitotique a été étudié grâce à l'analyse de mutants thermosensibles du cycle cellulaire de levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae). Ces mutants sont repéré facilement : lorsqu'on traite les levures au bénomyl (benzimidazole), une drogue dépolymérisante des microtubules, seuls les mutants n'ont pas de blocage de mitose. Il y a passage du point de contrôle alors que le fuseau est altéré. Ces mutants sont appelés mutants du check point mitotique. Grâce à l'étude de ces mutants, on a pu mettre en évidence trois familles de gènes importants pour ce processus : - Les gènes Mad (Mitotic arrest deficient) : Mad1 et Mad2 - Les gènes Bub (Budding uninhibited by benomyl) : Bub1, BubR1 et Bub3 - Les gènes Msp (Monopolar spindle) : Msp1 Toutes les protéines codées par ces gènes s'associent au domaine externe du kinétochore durant la prophase ou durant la pro-métaphase. Elles vont quitter progressivement le kinétochore lorsque les paramètres d'attachement au fuseau mitotique et de tension sont validés. Mad 2 peut se présenter sous deux formes : oMad2, qui est ouverte et inactive et cMad2, qui est fermée et active. Le passage de l'état oMad2 à l'état cMad2 se fait grâce à son interaction avec Mad1. Une fois activée, cMad2 permet la séquestration de certaines protéines. L'accrochage du complexe Mad1-cMad2 au kinétochore est possible par l'intermédiaire de RZZ et le recrutement de Mad1 au niveau du kinétochore est géré par la protéine Comet. Lorsque le kinétochore est libre, le complexe Mad1/cMad2 est attaché au kinétochore. Dans le même temps, la protéine CENP-E est également en interaction avec le kinétochore. Elle est dans un état relâchée, ce qui permet l'interaction avec 3 kinases Bub (1, R1 et 3) actives. Celles ci réalisent des phosphorylations inhibitrices, le point de contrôle SAC est donc activé et la mitose bloquée. Lorsque CENP-E est en interaction avec un microtubule et que le kinétochore est correctement occupé, il y a libération des 3 kinases Bub, du fait du changement de forme de la CENP, et libération du complexe RZZ-Mad1 de par son interagir avec une dynéine. Il n'y a donc plus de production de c-Mad2 et plus de séquestration de protéines. De plus, les kinases ne sont plus fonctionnelles et n'on plus d'activité de phosphorylation. Le point de contrôle SAC est donc inactivé et il y a sortie de mitose. En cas d'occupation anormale du kinétochore, c'est à dire lorsqu'il y a attachement mais pas la tension nécessaire, seule l'un des deux processus est effectué : L'attachement du microtubule permet à la dynéine d'interagir avec le complexe RZZ/Mad1 mais la CENP-E n'est pas sous tension et est dans un état relâché. De ce fait, il n'y a plus de séquestration de protéines mais les kinases Bub sont toujours attachées à CENP-E, elles sont actives et réalisent des phosphorylations inhibitrices. Le point de contrôle est donc toujours actif et il n'y a pas de sortie de mitose. 3. Sortie de mitose : Activation de l'APC/C Il suffit de dégrader Scc1 pour pouvoir ouvrir les cohésines. Les chromatides sont alors séparées et migrent vers les deux pôles opposés. C'est la séparase-Esp1 (extra-spindle poles) qui gère la dégradation de Scc1. Scc1 peut être dégradée par la séparase au niveau de deux sites. Ces deux sites de coupure sont utiles pour contrer une éventuelle mutation d'un des sites. Ainsi, si un seul site est muté, la séparation des chromatides est toujours possible. La séparase-Esp1 est séquestrée par la sécurine-Pds1 (precocious division of sister chromatids) tant que le point de contrôle SAC est activé. Une fois ce point de contrôle passé, la sécurine va être reconnue par le complexe APC/cyclosome actif (elle contient la D-box). Celui ci ubiquitine la sécurine qui sera donc reconnue par le protéasome puis détruite. Esp1 est donc libérée et peut dégradé Scc1. L'inhibition de la séparase est réalisée grâce à sa séquestration par Pds1. De ce fait, une mutation de la sécurine rend la séparase constitutivement active. Cela pose d'énorme problème, car la mitose ne peut donc pas avoir lieu. Pour contrer cela, le complexe CyclineA/Cdk2, majoritairement actif durant la phase S, est activé en faible quantité durant la phase G2 et les premières phases de la mitose. Durant la prophase et la métaphase, il a pour fonction de phosphoryler toutes les séparases libres. Ainsi, en cas de mutation de la sécurine, les séparases sont quand même inhiber par une phosphorylation. Pour pouvoir activer la transition métaphase-anaphase, il faut donc également désactiver le complexe cycline A/cdk2. Pour cela, le complexe APC/cyclosome ubiquitine la cycline A (qui a une D-box), se qui permet sa reconnaissance par le protéasome et sa dégradation. 2. Activation de la phosphatase KAP L'inactivation de SAC permet de préparer la cellule à sortir de la mitose. Pour cela, il y a dégradation de la cycline B et donc inactivation du MPF. La cycline B est ubiquitinée par l'APC/cyclosome (elle possède D box et KEN box) puis dégradée par le protéasome. De plus, il y a déphosphorylation de Cdk1 par la protéine KAP (ou Cdc14), ce qui contribue à l'inactivation du MPF. KAP est une phosphatase inhibitrice qui assure une sortie coordonnée de la mitose. Avant l'anaphase, Cdc14 est séquestré dans le nucléole par Net1. La transition métaphase-anaphase permet de la libérer. Le complexe MPF a phosphorylé Swi5 durant le point start, Sic1 durant la phase G1 et Cdh1 durant la phase S. La phosphatase KAP a cinq rôles à la fin de la mitose. Elle déphosphoryle : - Cdc28 / Cdk1 sur la tyrosine 161 (inhibition) : Cela permet l'inhibition du complexe MPF - Sic1 (activation) : Elle va ensuite inhiber l'activité du complexe MPF en inhibant l'interaction entre la cycline et cdc28 / cdk1. - Swi5 : Il y a changement de conformation de Swi5, ce qui démasque sa séquence NLS et permet son import nucléaire. Swi5 est un facteur de transcription qui permet la production de Sic1 supplémentaire. Cela augmenter encore plus l'inhibition de MPF. - Ase1 durant l'anaphase : Elle délocalise et n'interagit plus avec Eg5. Eg5 n'est plus bloquer et reprend son rôle de moteur moléculaire. - Cdh1 durant la télophase (activation) : Il va interagir avec l'APC et former l'APC/cyclosome. Celui ci ubiquitinera la cyclineB qui sera dégrader par le protéasome. Remarque : MPF correspond à cycline B/cdk1 pour l'espèce humaine et à cycline/cdc28 pour la levure. Il est inhibé durant l'anaphase mais la cycline B n'est dégradée que durant la télophase. VI. Anaphase : Ascension polaire des chromosomes 1. Changement de la dynamique des microtubules Durant l'anaphase, il y a un changement de dynamique des microtubules. Ceux ci vont subir un raccourcissement intense à cause d'une forte dépolarisation. Cela permet une rapide montée des chromosomes vers les pôles. La force de montée est générée au niveau des kinétochores par : - Des moteurs CENP-E : La protéine centromérique CENP-E est le moteur de l'anaphase. - La dépolarisation des microtubules par les extrémités "+". La dépolarisation entraine l'anneau de Dam1 qui relie le microtubule au kinétochore. L'anaphase est divisée en deux sous phases, l'anaphase A et l'anaphase B, qui sont associées à deux dynamiques de microtubules différentes. 2. L'anaphase A L'anaphase A correspond au début de l'ascension polaire des chromosomes. Cette ascension est seulement générée par le mouvement de CENP-E qui entraine une dépolarisation intense. Il n'y a aucun mouvement du fuseau mitotique et il garde donc la taille qu'il avait à la fin de la métaphase. 3. L'anaphase B Il y a un étirement supplémentaire du fuseau mitotique et donc une augmentation de sa taille. Cela est réalisé par des moteurs de type dynéine (qui rapproche les centrosomes de la membrane plasmique en jouant sur les microtubules astraux) et à la protéine Eg5 (qui éloigne les deux centrosomes l'un de l'autre en jouant sur le glissement des microtubules polaires). C'est la délocalisation (par phosphorylation) de Ase1 qui permet la réactivation de Eg5. Le recrutement de MKLP1, qui est un moteur "+", permet d'accentuer ce mouvement du fuseau. En effet, il a rôle similaire à Eg5. La dépolarisation intense des microtubules continue d'avoir lieu en plus du mouvement des centrosomes. Lors de la séparation des chromatides au niveau de la plaque équatoriale, il y a libération et dépôt des INCENPs (qui formait le complexe centromère-kinétochore) à cet endroit. Ainsi, elles vont permettre, par leur présence, d'identifier l'ancienne plaque équatoriale, c'est à dire le centre de la cellule. De plus, elles sont libérés durant la transition métaphase-anaphase. Elles vont donc marquer le début de l'anaphase. Les INCENPs vont donc jouer un double rôle de marqueur temporel et de marque spatial. Remarque : Il faut aussi s'assurer que les chromosomes se séparent de façon équilibrer et se concentrer aux pôles, en deux lots de chromosomes. Autrement dit, il ne faut pas qu'il y ait de dispersion. VII. Télophase et cytodiérèse : Retour à l'état interphasique La télophase et la cytodiérèse sont des phases séparées ou non en fonction de l'espèce. La télophase correspond à la reformation du noyau et la décondensation des chromosomes. La cytodiérèse correspond à la formation des deux cellules filles. Durant ces deux phases, il faut reprendre les activités métaboliques normales qui ont été inhibés durant la mitose. Pour retourner à l'état interphasique, il faut donc déphosphoryler toutes les protéines cibles de MPF : - La myosine 2 va ainsi pouvoir interagir avec les microfilaments et permettre de réorganiser le fuseau mitotique comme il doit être dans une cellule en interphase - Les histones, les HMG et les condensines qui vont permettre la décondensation des chromosomes et leur retour à l'état de chromatine. - Les lamines pour pouvoir reformer l'enveloppe nucléaire autour des chromosomes 1. Réorganisation du fuseau central Comme on l'a dit précédemment, les INCEPs sont des marqueurs temporels et positionnel. Il sont responsable du déclenchement d'une succession d'évènements : rassembler) et au recrutement de la myosine II. L'anilline est synthétisée et s'accumule dans le noyau (importation grâce à ces trois séquences NLS) durant les phases G1 à G2. Lors de la métaphase, le noyau a disparu et les annillines migrent vers le cortex cellulaire (c'est à dire en périphérie). A l'anaphase, il y a activation des anallines se trouvant au niveau du cortex équatorial uniquement puisque ce n'est qu'à cet endroit que RhoA et CitronK sont activées. La localisation dans le noyau est une sécurité : en plus de ne pas être active, l'anilline n'est pas disponible durant l'interphase. 3. Reformation de l'enveloppe nucléaire Dans chacune des cellules filles, il y a en même temps décondensation des chromosomes et reformation de l'enveloppe nucléaire autour des chromosomes. Remarque : Après division en deux cellules filles, on aura bien un centrosome unique dans chacune des cellules. Les lamines ont à la fois une affinité particulière pour l'enveloppe nucléaire et pour la chromatine. Elles vont donc interagir avec les deux lors de la reformation de la lamina et de l'enveloppe nucléaire. La lamina participe également au positionnement des chromosomes dans la cellule. Lors de la destruction de l'enveloppe nucléaire, au début de la mitose, les lamines B sont restées associées à la membrane des vésicules nucléaire. A la fin de la mitose, il y a eu inactivation du MPF et donc déphosphorylation de toutes les lamines. Lors du recrutement des lamines, il y a recrutement des lamines A et C libres d'une part et des lamines B ancrées aux vésicules d'autres part. la déphosphorylation permet la fusion des vésicules et la polymérisation de la lamina (interaction des lamines entre elles). La lamine B a un double rôle d'identification des vésicules nucléaires et du contrôle de la reformation de l'enveloppe et de la lamina autour des chromosomes. 4. Achèvement de la mitose Le retour à l'état interphasique est permis par la déphosphorylation des protéines cibles du MPF : - Les protéines du filament intermédiaire (IFPs), ce qui permet au cytoplasme de reprendre une densité de cellule interphasique (moins fluide) - Les protéines de liaisons à l'actine (ABPs), ce qui permet de recréer le cortex cellulaire - La plaque d'adhérence, ce qui permet à la cellule de se fixer au support - Les MAPs et les moteurs, ce qui permet aux microtubules de redevenir longs et stables - Les protéines membranaires et les protéines Rab, ce qui permet de reformer des compartiments organisés, dynamiques et fonctionnels. - Les ARN polymérases et le facteur eEF1a, ce qui permet d'avoir de nouveau une activité transcriptionnelle et traductionnelle (puisque les chromosomes sont de nouveau accessibles, car à l'état décondensé). La fin de la mitose est caractérisée par la formation de deux cellules filles. Pour cela, il y a resserrement progressif de l'anneau contractile d'acto-myosines (c'est à dire que les microfilaments d'actines se ferment grâce aux myosines) jusqu'à avoir coupure en deux.
La mitose - Cours magistral dispensé en licence biologie.
Matière: Biologie cellulaire
Université: Université Catholique de Lille
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