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Sonde e ibridazione
Biologia molecolare (m-z) (ST01 3S038)
Università Politecnica delle Marche
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SONDE E IBRIDAZIONE
Il DNA a doppio filamento può andare incontro a processi di DENATURAZIONE (separazione dei due filamenti) e RIASSOCIAZIONE. Questo processo reversibile viene impiegato nelle tecniche di biologia molecolare che utilizzano sonde a DNA per identificare o analizzare le sequenze nucleotidiche di DNA o RNA.
SONDA: Molecola a DNA a singolo filamento con una sequenza nota che viene marcata (la marcatura la rende identificabile nel pool di acidi nucleici). La sua sequenza nucleotidica sarà complementare a quella dell’acido nucleico di interesse (bersaglio).
IBRIDAZIONE: Momento in cui la sonda lega il bersaglio (appaiamento di regioni complementari)
Processo: Il pool di acidi nucleici viene immobilizzato (legato tramite ossatura di zucchero-fosfato) su un supporto solido e rigido (membrana di nitrocellulosa o nylon). La sonda viene messa in soluzione e viene utilizzata in eccesso rispetto alla sequenza bersaglio. La membrana di nitrocellulosa si forma con calore (80° x 12h) o con radiazioni UV. La sonda viene marcata in modo radioattivo ( il precursore per sintetizzare la sonda radioattiva è il nucleotide tri fosfato, come isotopi radioattivi usiamo: 32P 3H 14C, il più usato è P , se lo utilizzo vado a marcare il nucleotide trifosfato nel gruppo P in alfa perché gli altri gruppi fosfato vengono persi quando si formano i legami). La sonda viene aggiunta alla membrana e una volta legata andrà a formare legami specifici nelle regioni complementari e legami aspecifici in quelle non complementari. Dopo il lavaggio rimarranno solo i legami specifici. Andiamo a visualizzare il tutto su lastra a raggi x (autoradiografia) per visualizzare il legame sonda- bersaglio.
Utilizzo di una sonda a DNA per l’identificazione di una sequenza clonata all’interno di una libreria (ibridazione su colonna)
Si procede con una semina su piastra in cui si sono sviluppate colonie batteriche, sovrapponiamo la membrana di nitrocellulosa e una porzione di colonie si attaccano al filtro. Le cellule batteriche sono lisate e il DNA è denaturato (alcali + proteasi), successivamente si forma la membrana di nitrocellulosa e si procede con l’ibridazione.
Infine dopo aver identificato il DNA ricombinante di interesse tramite lastra raggi x si riprende la piastra madre, cerco le colonie che hanno impressionato la membrana e le lavoro in maniera più specifica, trasferisco le cellule in un mezzo di cultura e le faccio crescere per ulteriori analisi.
- Marcatura di una sonda a DNA mediante il metodo RANDOM PRIMER:
Viene denaturato il DNA con bollitura e raffreddamento in ghiaccio, all’interno metto dei primer esanucletidici che si andranno ad appaiare a random. Frammento di Klenow: Porzione della DNA polimerasi I di E. coli dotato di attività polimerasica 5’-3’ ed esonuclasica 3’-5’ ma privo dell’attività esonucleasica 5’-3’. Esso in presenza di precursori radioattivi ricostituisce la continuità dei frammenti senza rimuovere i primer estesi, in questo modo abbiamo realizzato una sonda.
- Marcatura di una sonda mediante NICK TRANSLATION: Sequenza di DNA di interesse trattato con DNAsi I (fa un taglio solo su un filamento) si aggiunge la DNA polimerasi I (alcune basi sono parcate con isotopo 32P) che utilizza la tecnica di nick translation dove i nucleotidi vecchi vengono sostituiti con dei nuovi per mezzo dell’attività esolnucleasica 5’-3’.
NORTHERN BLOT: Metodologia per l’analisi dell’espressione di un gene a livello dei RNA messaggero. Tecnica di ibridazione con sonda di DNA e un bersaglio a RNA. Procedimento: Rompo la cellula, isolo la frazione di RNA e separo i frammenti con elettroforesi su gel. L’RNA va dal polo negativo a quello positivo come il DNA. Dopo elettroforesi si istituisce il BLOTTING, bisogna trasferire gli acidi nucleici dal gel alla membrana. Si prende una vaschetta con supporto rigido con fogli di carta, gel e altri fogli con dei pesetti, tutto messo su tampone. Il primo foglio assordente sarà più lungo, assorbe il tampone e lo trasferisce per capillarità ai fogli superiori, raggiunto il gel il tampone lo attraversa, stacca le molecole di RNA e le trasporta verso l’alto nella membrana che rappresenta un filtro per l’RNA ma non per il tampone. Il peso comprime il sistema per non far formare bolle d’aria. Quando stacchiamo la membrana andiamo bene a fissare l’RNA con calore o raggi UV e a questo punto abbiamo l’RNA con il frammento di interesse (ibridazione).
SEQUENZIAMENTO DEL DNA: metodo di Maxam-Gilbert Metodo chimico basato sulla degradazione chimica della catena di DNA, i frammenti di DNA a singolo filamento vengono marcati con isotopo 32P all’estremità 5’ e poi suddivisi in 4 aliquote, ciascuno dei 4 campioni viene sottoposto ad un trattamento chimico differente in grado di rompere la molecola in punti definiti. Si generano frammenti di diversa lunghezza.
Sonde e ibridazione
Corso: Biologia molecolare (m-z) (ST01 3S038)
Università: Università Politecnica delle Marche
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