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Fraccionamiento subcelular

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Bioquimica y biologia molecular II

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Universidad

Universidad de Concepción

Año académico: 2016/2017

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Fraccionamiento subcelular La primera etapa de la purificación es extraer la proteína, eso es lo que se hace con el proceso de ruptura y el proceso de purificación. Si analizamos otras estructuras más complejas que las proteínas, por ejemplo, un virus, veremos que hay una capsula proteica que contiene el material genético además de proteínas que permiten su unión al ADN celular, existen un gran cantidad de actividades que se estudian usando a los virus como modelos biológicos, por ejemplo, las proteínas implicadas en la síntesis proteica, la regulación de genes, el control de la proliferación celular, el transporte de proteínas dentro y fuera de la célula, etc. Entonces si yo quiero hacer una investigación acerca de esto tendré que usar virus como modelo biológico, así que tendré que procesar virus y proteínas de virus. Lo mismo uno puede hacer con bacterias o con levaduras, o con el gusano redondo (Caenorhabditis elegans) el cual a contribuido bastante al desarrollo de estudios, porque se desarrolla rápidamente (un par de semanas), aunque lo más importante son sus pareces transparentes que nos permiten ver su desarrollo interno. Existen también organismos más complejos como la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) o el pez cebra, el cual también permite una gran avance en el desarrollo por su bajo costo de mantenimiento y rápido desarrollo; cualquiera sea el modelo biológico elegido, como un ratón de laboratorio o una planta como la Arabidopsis thaliana, en cualquier momento uno puede necesitar purificar una proteína; aunque también uno puede purificar genes u otras estructuras celulares. El primer paso para la purificación es la ruptura celular, no la ruptura de tejidos, sino que la ruptura de la célula para la liberación de las proteínas. Existen métodos suaves, para células frágiles, pues hay células que tiene una membrana más débiles y otras más resistentes (como la célula vegetal o las bacterias Gram positivas); entonces existen métodos según la resistencia de la membrana, como por ejemplo podemos romper células al causar un shock osmótico. Si ustedes han visto como en agua destilada uno gotea una gotita de sangre, y por la diferencia de presiones uno rompe la membrana de los glóbulos rojos y se queda los glóbulos rojos sin su contenido, algo así como los “fantasmas de los glóbulos rojos”. Lo mismo uno puede hacer con las bacterias, pero no solo con la diferencia osmótica sino que ayudados por la digestión enzimática, para debilitar la membrana con lisozima. Las levaduras son tan resistentes que necesitan ser digeridas con químicos y ahí hablamos del uso del tolueno; pero, también hay células fáciles de romper de forma manual (como las células animales) y ahí hablamos de homogenización manual de tejidos. Existen tejidos que son más resistentes, como los cartílagos, donde se necesita trabajar con métodos más agresivos, nos referimos a los métodos moderados, y si hay métodos moderados es porque también hay métodos vigorosos; todo dependiendo de la dureza de la membrana celular. Analicemos mejor los métodos: METODOS SUAVES: Choque osmótico: Se usa principalmente en bacterias, las que se dejan en suspendidas en un tampón, esto se hace realizando un cultivo bacteriano para llegar a las 10^8- 10^10 bacterias, lo que podría ser un MacFarllan de 5 o 6. Luego de eso hay que lavar las bacterias para limpiarlas de su medio de cultivo, porque pueden quedar con proteínas o péptidos dando vuelta. Además de incuban con EDTA, el cual se une a los cationes bivalentes, quedando así la membrana debilitada, (al lavar me refiero yo las lavo y centrifugo), y ahí las dejo suspendidas en agua destilada y explotan por la diferencia de presiones osmóticas. Suponga que está trabajando con bacterias Gram negativas que tiene una membrana plasmática, un espacio periplásmico y una membrana externa, y ya está desestabilizado la membrana externa con el EDTA, pero supongamos que en lo que ustedes están interesados es en tener proteínas que están en el espacio periplásmico como la betalactamasa (proteína que sirve para hidrolizar antibióticos). Si sigue el protocolo romperá la célula por completo y liberará proteínas que solo servirán de contaminación, para eso hay que cuidar usar hacer que la presión osmótica solo rompa la membrana externa, libere el contenido del espacio periplásmico, pero no rompa la membrana celular; esto se puede hacer agregando sacarosa al agua destilada, lo que hace que la presión osmótica suba, pero no mucho, logrando lo que buscamos. Lisozima: Cuando tengo una célula más resistente, o cuando no me interesa solo las proteínas del espacio periplásmico, yo puedo hacer una digestión con lisozima, si la recuerdan sabrán que es un antibiótico creado por bacterias para matar a otras bacterias, actúa degradando las membranas bacterianas. Si yo incubo bacterias con lisozimas, debo esperar un poco y las membranas estarán debilitadas. Toluenolisis: Cuando uno trata con levaduras debe usar tolueno, porque al usar cambios de presión osmótica o lisozimas, están no sufren daños; aunque el contra es que el tolueno es tóxico y cancerígeno; para eso existe una alternativa con amonio; las levaduras se dejan en suspensión por 1 a 3 horas, pues son muy resistentes. METODOS MODERADOS: Sonicadores: Los sonicadores son máquinas que producen ultrasonido, este se usa para romper la membrana celular. Este aparato debe usarse con protectores de tímpano, pues son sonidos tan altos que a largo plazo produce sordera. El sonido producido por el sonicador se efectúa en un tubo el cual vibra muy rápido, pero como todo trabajo mecánico hay producción de calor, por lo que es necesario dejar la muestra en un baño de hielo; otro inconveniente es la oxidación de la muestra, para evitarlo se agrega una reductor a la solución y se puede realizar la operación sin problemas. fijo, generalmente en 34º, con está posición siempre tendrán un arrastre desde el centro hasta el fondo, cabe agregar que la fuerza que se ejerce sobre el tubo será la componente de la normal que es paralela el eje de la centrífuga. La centrífuga de rotor basculante posee cestas de ángulo variable, las que en un punto de la centrifugación quedarán perpendiculares el eje, arrastrando las partículas en suspensión hacia afuera del tubo. Para aumentar la velocidad estas centrífugas poseen una coraza protectora que por dentro esta con vacío, y que también cumple la función protectora, pues si la centrífuga no tiene en correcta posición el tornillo de unión entre canastillo y el eje, el canastillo saldrá disparado y lo contendrá la coraza. Las ultracentrífugas pueden alcanzar velocidad de 100 veces la aceleración de la fuerza de gravedad. Según el tamaño de las partículas será su arrastre, por ende, al variar las velocidades se obtendrán distintos precipitados y se podrá separar los distintos solutos de la solución. Si desde una muestra homogenizada la centrifugo a 10 veces la gravedad por 20 minutos, obtendré un precipitado de núcleos celulares; si tomo el sobrenadante y lo centrifugo a 100 veces la fuerza de gravedad por una hora obtendré un precipitado de mitocondrias, ahora el citosol que queda (se llama así porque está formado por la solución y las proteínas solubles, al centrifugar a 100 veces la gravedad por 20 minutos y por ende las células no tienen citosol, si no que citoplasma) se puede decir que posee la proteína en estado más puro, pero acompañada de otras proteínas que son contaminantes. ¿Pero cómo podemos estar seguros de que en la primera centrifugación se obtuvieron núcleos, suponiendo que no tenemos microscopio electrónico, ni tinciones especiales? Para estos casos se usan los anticuerpos para detectar el ADN, llamados antiDNA. Pero para identificar las distintas fracciones (precipitados) obtenidas aparte de las tinciones y los anticuerpos existen enzimas específicas que permiten reconocer las fracciones. El ADN se encuentra en los núcleos, en una primera centrifugación, la fosfatasa alcalina se encuentra en la segunda centrifugación, por sobre el ADN que comienza a descender, y por último, en la tercera centrifugación se halla la lactato deshidrogenasa en mayor medida y hay ausencia de ADN. 120% ADN 100% 80% Fosfatasa Alcalina 60% Lactato Deshidrogenasa 40% 20% 0% UNO DOS TRES Existen distintos tipos de protocolos de purificación de proteínas, dependiendo de la naturaleza de la muestra (levaduras, bacterias, plantas, etc), para lograr de una manera eficiente la purificación proteica con la menor pérdida posible de la proteína que se desea aislar.

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La primera etapa de la purificación es extraer la proteína, eso es lo que se hace con

el proceso de ruptura y el proceso de purificación.

Si analizamos otras estructuras más complejas que las proteínas, por ejemplo, un

virus, veremos que hay una capsula proteica que contiene el material genético además de

proteínas que permiten su unión al ADN celular, existen un gran cantidad de actividades

que se estudian usando a los virus como modelos biológicos, por ejemplo, las proteínas

implicadas en la síntesis proteica, la regulación de genes, el control de la proliferación

celular, el transporte de proteínas dentro y fuera de la célula, etc. Entonces si yo quiero

hacer una investigación acerca de esto tendré que usar virus como modelo biológico, así

que tendré que procesar virus y proteínas de virus. Lo mismo uno puede hacer con

bacterias o con levaduras, o con el gusano redondo (Caenorhabditis elegans) el cual a

contribuido bastante al desarrollo de estudios, porque se desarrolla rápidamente (un par

de semanas), aunque lo más importante son sus pareces transparentes que nos permiten

ver su desarrollo interno.

Existen también organismos más complejos como la mosca de la fruta (Drosophila

melanogaster) o el pez cebra, el cual también permite una gran avance en el desarrollo

por su bajo costo de mantenimiento y rápido desarrollo; cualquiera sea el modelo

biológico elegido, como un ratón de laboratorio o una planta como la Arabidopsis

thaliana, en cualquier momento uno puede necesitar purificar una proteína; aunque

también uno puede purificar genes u otras estructuras celulares.

El primer paso para la purificación es la ruptura celular, no la ruptura de tejidos,

sino que la ruptura de la célula para la liberación de las proteínas. Existen métodos suaves,

para células frágiles, pues hay células que tiene una membrana más débiles y otras más

resistentes (como la célula vegetal o las bacterias Gram positivas); entonces existen

métodos según la resistencia de la membrana, como por ejemplo podemos romper células

al causar un shock osmótico. Si ustedes han visto como en agua destilada uno gotea una

gotita de sangre, y por la diferencia de presiones uno rompe la membrana de los glóbulos

rojos y se queda los glóbulos rojos sin su contenido, algo así como los “fantasmas de los

glóbulos rojos”.

Lo mismo uno puede hacer con las bacterias, pero no solo con la diferencia

osmótica sino que ayudados por la digestión enzimática, para debilitar la membrana con

lisozima.

Las levaduras son tan resistentes que necesitan ser digeridas con químicos y ahí

hablamos del uso del tolueno; pero, también hay células fáciles de romper de forma

manual (como las células animales) y ahí hablamos de homogenización manual de tejidos.

Existen tejidos que son más resistentes, como los cartílagos, donde se necesita

trabajar con métodos más agresivos, nos referimos a los métodos moderados, y si hay