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Enzimología clínica

Estudio in vitro e in vivo de propiedades bioquímicas, con el propósit...

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Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II (Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II)

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Año académico: 2018/2019

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Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II Enzimología clínica Componentes sanguíneos → Luego de que la muestra llega al laboratorio, se debe procesar para dividir los componentes líquidos (plasma) y los elementos formes. → La cantidad de plasma presente en la muestra va a depender del hematocrito, que es la cantidad porcentual de glóbulos rojos presentes. → El valor normal del hematocrito es aproximadamente 40%, por lo que el 60% corresponde a plasma. → La determinación analítica de distintos compuestos requiere ciertos requisitos de anticoagulantes presentes en la muestra. → El plasma se encuentra conformado por: - 92% de agua, en la cual están disueltos algunos compuestos. - 7% corresponde a proteínas plasmáticas: albumina (60%), globulinas (35%), fibrinógeno (4%), proteínas regulatorias como las enzimas (menor a 1%). - 1% de otros solutos como electrolitos, nutrientes orgánicos y desechos orgánicos. Proteínas plasmáticas ➢ Las proteínas plasmáticas se dividen en dos fracciones principales: albúmina y globulinas. ➢ La clasificación general de las proteínas plasmáticas es la albumina y las globulinas, quien incluye a todo el resto de proteínas (Albumina + Globulinas = Proteínas totales). ➢ La función de la albumina es la mantención de la presión oncótica. ➢ Las paredes capilares son impermeables a las proteínas plasmáticas, por lo que ejercen una fuerza osmótica a través de la pared capilar, atrayendo agua desde el intersticio hacia la sangre = presión oncótica (albumina). ➢ Las proteínas plasmáticas generan 15% de la propiedad tamponante de la sangre por la ionización débil de sus grupos COOH o carboxilo y NH2 o amino (a pH fisiológico COO- y NH3+). ➢ Entonces, todas las proteínas cumplen un rol de mantener la presión osmótica y regular el pH sanguíneo, aunque el tampón bicarbonato ácido carbónico seguirá siendo siempre el más importante. Albumina y presión oncótica ➢ Si los niveles de albumina circulante disminuyen no existe retención de agua a nivel vascular y esta se va a ir hacia el intersticio, lo que se manifiesta a través de el edema. ➢ Edema: acumulación de líquido en la zona intersticial o en cualquier cavidad orgánica (cuando ocurre en la cavidad abdominal es llamada ascitis). ➢ La disminución de la albumina puede ser debida a dos causas: - Disminución de la síntesis de albumina. - Aumento en la perdida de albumina. ➢ Su disminución de se puede asociar a: - Falla hepática, ya que la albumina se sintetiza a nivel hepático. - Déficit absortivo, ya que si existe una condición en la cual la absorción de proteínas esta disminuida o la ingesta de proteínas se encuentra disminuida no van a existir los aminoácidos necesarios para poder sintetizar la albumina. - Proteinuria nefrótica, ya que se encuentran disminuyendo los niveles de albumina, pero por aumento de la perdida. ¿Cuál es la función de las otras proteínas plasmáticas? - Transporte de moléculas: vitaminas, hormonas, lípidos, ferritina sintetizada en el hígado… - Coagulación sanguínea: factores de la coagulación sintetizados en el hígado… - Inmunidad: inmunoglobulinas sintetizadas en los linfocitos B, proteínas del complemento sintetizadas en el hígado… - Regulación: hormonas, enzimas… → Se encuentran en circulación porque de alguna forma o ejercen su función ahí o se deben transportar al lugar en donde van a ejercer su función. → Existen además algunas proteínas que no tienen función en circulación, pero cumplen con el rol de ser marcadores capaces de señalar algún tipo de daño. Algunas proteínas plasmáticas de importancia clínica Nombre de la proteína α1-antitripsina Función Inhibidor de proteasa β2-microglobulina Subunidad del complejo HLA Ceruloplasmina Enzima oxidasa Razón por la cual se pide Reducida en la deficiencia genética de α1-antitripsina. Se ha asociado con cuadros respiratorios. Evaluación de proteinuria tubular, por lo que hay menor reabsorción de proteínas pequeñas que fueron filtradas como la β2-microglobulina que es casi 100% reabsorbida. Cuando se encuentra presente una proteinuria tubular los niveles de β2-microglobulina se encuentran disminuidos. Es considerada un marcador tumoral inespecífico, ya que sube en diferentes tipos de cáncer. Tiene la característica de tener cobre en su estructura y su función tiene que ver con el transporte de cobre. Reducida en la enfermedad de Wilson. Enzimología clínica ➢ “Aplicación del conocimiento de las enzimas al diagnóstico, seguimiento y pronóstico de una enfermedad” ➢ ¿Cómo? → “Determinación de la actividad enzimática de diversas enzimas intracelulares (en plasma)” ¿Cuál es el origen de las enzimas intracelulares que están presentes en el plasma? - La evaluación de los niveles plasmáticos de estas enzimas permite “informar” sobre el “estado funcional” del órgano específico de origen (recambio, lisis, sobreexpresión, hiperplasia). → En todos los tejidos deben existir vasos sanguíneos, a los cuales llegan todos los desechos de las células. → La muerte de algunas células va a provocar que fracciones de estructuras intracelulares de estas pasen a circulación, por lo que enzimas intracelulares se van a encontrar a nivel sanguíneo. → Siempre hay enzimas circulantes en el plasma, pero deben estar en baja concentración. → Cuando se tiene mayor destrucción de células en el tejido de origen de una enzima en específico, va a haber mayor concentración de esta a nivel plasmático. → En un recambio celular relativamente normal también va a existir una pequeña elevación de enzimas. Enzimas ➢ Catalizadores biológicos de origen proteico (99%), es decir, aceleran las reacciones que ocurren en el organismo. ➢ Alta especificidad → Son específicas para cada sustrato debido a su sitio activo. ➢ Alta eficiencia → No se necesitan cantidades altas de enzimas para ejercer su función. ➢ Saturables → Tienen un límite en el cual están trabajando a su capacidad máxima y no pueden catalizar más reacciones. ➢ Función dependiente de estructura terciaria-cuaternaria. ➢ Estructura y función dependiente de la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la presencia inhibidores. ➢ Los intervalos de referencia de las enzimas dependen de la temperatura a la cual se hizo la determinación en el laboratorio. ➢ Las enzimas a diferentes temperaturas son capaces de funcionar, pero siempre van a tener una temperatura optima a la cual van a trabajar mejor. ➢ En el laboratorio lo que vamos a determinar es la actividad de las enzimas. Función dependiente de la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la presencia de inhibidores Sustrato: Molécula sobre la cual actúa una enzima para generar una reacción. Producto: Molécula o moléculas finales de una reacción. Sitio activo y catalítico: El sitio activo es el lugar en el cual se une el sustrato, mientras que el sitio catalítico es el lugar dentro del sitio activo en donde un grupo de aminoácidos participan en el proceso catalítico. Enzimas simples: Aquellas que requieren solamente del componente peptídico. Enzimas conjugadas: Aquellas que además del componente peptídico requieren de otra molécula que las ayuda en su función, sin la cual no podrían ejercer su acción. Unión del sustrato con el sitio activo Existen dos teorías: ✓ Llave - cerradura → Supone que la estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que un llave encaja en una cerradura. Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto. ✓ Ajuste inducido → Nos dice que en algunos casos, el centro activo adopta la conformación idónea solo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto. Es la teoría más acertada. Enzimas conjugadas ➢ Apoenzima → cadena polipeptídica → Enzima inactiva. ➢ Holoenzima → cadena polipeptídica + cofactor → Enzima activa. ➢ Dentro de los cofactores se encuentran: - Iones metálicos - Coenzimas, las cuales son moléculas orgánicas que pueden actuar como cosustratos o como grupos prostéticos. ➢ Si la coenzima está unida muy fuertemente (covalente o no covalentemente) a la cadena polipeptídica se denomina grupo prostético. Cofactores → Son iones que normalmente no se encuentran en concentraciones muy altas en circulación, pero son necesarios. Clasificación funcional de las enzimas 1. Oxido-reductasas (reacciones redox): deshidrogenasas, reductasas, oxidasas → Por lo tanto utilizan como coenzima NAD o FAD 2. Transferasas (reacciones de transferencia de grupos funcionales) 3. Hidrolasas (reacciones de hidrolisis) 4. Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) 5. Isomerasas (reacciones de isomerización) 6. Ligasas (reacciones de formación de enlaces con uso de ATP) Variantes enzimáticas: isoenzimas ➢ Son proteínas que catalizan la misma reacción química, con los mismos requerimientos (sustratos y cofactores), pero con propiedades cinéticas y fisicoquímicas diferentes (Km, Vmax). ➢ Se expresan en tejidos distintos. ➢ Pueden tener distinta inmunorreactividad, es decir, pueden estar formadas por diferentes cadenas polipeptidicas (cadenas proteicas). ➢ Monomérica codificada por genes distintos (amilasa). ➢ Oligomérica con distintas combinaciones de monómeros (LDH, CK). Isoenzima lactato deshidrogenasa (LDH) ➢ Cataliza la transformación de piruvato a lactato. ➢ Existen 5 isoenzimas de lactato deshidrogenasa. ➢ Proteína oligomérica, lo que significa que está formada por más de una cadena polipeptidica, específicamente 4 cadenas. ➢ Estas cadenas polipeptidicas pueden ser de dos tipos al ser generadas por 2 genes distintos: - Cadena M (músculo) - Cadena H (corazón) ➢ Según como se unen estos monómeros se forman las distintas isoenzimas. ➢ Isoenzimas tejido específicas. ➢ Dependiendo de la combinación de cadenas polipeptidicas el tamaño de la cadena es distinto. ➢ Cada tejido tiene un requerimiento distinto, por lo que dependiendo del requerimiento del tejido es el tipo de LDH que se va a encontrar catalizando lentamente o rápidamente la reacción. → La LDH es una isoenzima que se encuentra en todos los tejidos. → Si la LDH en circulación se encuentra elevada nos indica que existe algún tipo de daño en un tejido, pero no nos dice cual, por lo que es muy inespecífica. → Si se hiciera una electroforesis para las distintas isoenzimas de la LDH se podrían diferencias fácilmente, ya que tienen pesos moleculares diferentes. → La cadena más grande es la H, mientras que la M es la más pequeña. → La LDH1 y la LDH2 son las más abundantes, siendo la LDH4 y la LDH5 las menos abundantes. → La que es más específica es la LDH5. → La Km nos da una idea sobre la afinidad que tiene la enzima por su sustrato, cuanto más alta es la Km, más baja es la afinidad de la reacción. → En el corazón el piruvato generado tiene que tratar de irse hacia el ciclo de Krebs, por lo que esa es la cadena metabólica que tiene que estar prendida, tratando de que la LDH se encuentre lo más apagada posible. En el corazón se encuentra la LDH1, que es aquella que tiene la más alta Km y por lo tanto la afinidad de la reacción se encuentra disminuida. → Por otro lado, en el musculo el piruvato generado tiene que tratar de irse hacia la generación de ácido láctico, por lo que esa es la cadena metabólica que tiene que estar prendida, tratando de que la LDH se encuentre lo más prendida posible. En el musculo se encuentra la LDH5, que es aquella que tiene la más baja Km y por lo tanto la afinidad de la reacción se encuentra aumentada. ¿Qué enzimas se analizan? → Aquellas enzimas que son de importancia clínica ¿Cómo se determinan experimentalmente? → Se evalúa la actividad enzimática de estas enzimas, la cual es una evidencia de que la enzima está presente en una cierta cantidad. Enzimas plasmáticas de importancia clínica ➢ Basalmente todas estas enzimas están presentes en circulación, por el recambio celular normal (pero no ejercen su función aquí). → El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración “in vitro” de su actividad enzimática. ¿Por qué se elevan los niveles plasmáticos de enzimas? 1. Muerte celular - Hepatitis (GOT, GPT) - Ejercicio intenso (CK) - Hemólisis (GOT) - Infarto cardíaco (CK) 2. Aumento de la síntesis - Etanol y antiepilépticos (GGT) 3. Disminución de vida media, es decir, del tiempo necesario para que la concentración o los niveles de algo disminuyan a la mitad - Falla renal (disminuye clearance de amilasa y lipasa) ¿Qué es necesario considerar para la interpretación de la elevación de enzimas plasmáticas? 1.- Tejido de origen de la enzima → Los números presentes nos hablan de la cantidad de veces más que la enzima se encuentra elevada con respecto a su concentración en circulación. Por ejemplo, si la concentración de GOT sanguínea es 35 en el hígado se encuentra 7000 veces más. → En las enzimas no se habla de concentración, sino que de veces de elevación. → Es necesario saber cómo se distribuyen las enzimas para poder interpretarlas. 2.- Localización de las enzimas dentro de la célula → Las enzimas citoplasmáticas salen más fáciles que las enzimas mitocondriales, porque debe existir un doble rompimiento de membrana para que estas puedan salir. Por lo tanto, el aumento de enzimas citoplasmáticas indica que la alteración celular no es tan severa, mientras que el aumento de enzimas mitocondriales indica que el daño celular es más severo. 3.- Vida media de la enzima → Saber interpretar los tiempos de desaparición de esa actividad enzimática aumentada puede ayudar a evaluar la evolución del cuadro. → Cuando comienza el tiempo de recuperación la enzima detectada debería comenzar a bajar a nivel sanguíneo. → Cada enzima tiene una cinética de elevación especifica. ✓ ✓ ✓ ✓ Si se almacenan y son inestables… Si existen inhibidores presentes… Si existen mutaciones que (-) actividad… Si son modificadas por proteasas en circulación y pierden actividad… → Cuando hablamos de CK-MB hablamos de la determinación de la actividad enzimática, pero cuando hablamos de la CK-MB masa hablamos de la determinación de su cantidad a través de inmunoensayos. → La CK-MB es la única isoenzima que normalmente se pide. → La técnica para medir la actividad enzimática de la CK-MB no es muy buena, porque no es capaz de discrimina correctamente. Determinación de la actividad enzimática ➢ Las enzimas normalmente están presentes en concentraciones muy bajas en los líquidos biológicos. ➢ Con frecuencia es difícil aislarlas. ➢ En el laboratorio se mide la actividad enzimática. La actividad enzimática se relaciona directamente con la concentración de la enzima Actividad enzimática ➢ Se expresa en unidades de actividad enzimática por unidad de volumen. ➢ UI/ml, UI/L (U/ml, U/L). ➢ 1 UI → Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto (en condiciones definidas). No necesariamente tiene que ver con la concentración de la enzima, ya que una UI para una enzima puede ser una molécula, pero para otra pueden ser 4 moléculas las equivalentes a una UI. ➢ Para normalizar el concepto de moles se está tratando de cambiar la unidad en que se expresa la actividad enzimática de UI a katal. ➢ 1 Katal (Kat) → Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol de sustrato en producto por segundo (en condiciones definidas). → Existen algunas enzimas que se pueden expresar con más de alguna unidad, pero la más utilizada es la UI/ml. Determinación de actividad enzimática ➢ A través de técnicas fotométricas. ➢ Métodos de medición: - Aparición de algún producto / unidad de tiempo. - Desaparición de algún sustrato / unidad de tiempo. - Variación de un cofactor enzimático / unidad de tiempo. ➢ Deben realizarse en condiciones previamente definidas (temperatura, pH, concentración de sustrato, tiempo). ➢ La diferencia entre una reacción que mide enzimas y una que no lo hace es que en la primera las enzimas provienen de la muestra que se está estudiando, mientras que en la segunda las enzimas vienen en los reactivos y son utilizadas para poder llevar a cabo una reacción que va a ser medible a través de los productos generados. Por lo tanto, la diferencia radica en donde surge la enzima necesaria para hacer la determinación. Determinación en una reacción acoplada → Es una técnica enzimática, indirecta y UV. Factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas y que deben ser controlados ✓ Temperatura de la reacción ✓ pH de la reacción ✓ Fuerza iónica (es la concentración general de iones que existen en una solución) ✓ Presencia-Concentración de: - Inhibidores (pueden existir en la muestra) - Cofactores - Sustratos - Enzima Efecto de la temperatura en la actividad enzimática ➢ Las expresiones de los intervalos de referencia para las enzimas se expresan según la temperatura a la cual se determina la reacción. ➢ Es más alta la de 37°C porque a esa temperatura se encuentra en su temperatura optima, mientras que a los 30°C se aleja de esa temperatura. ➢ Existen algunas enzimas como la CK que son sensibles a la temperatura, ya que por ejemplo esta enzima comienza a denaturarse a 37°C. ➢ Amilasa comienza a denaturarse a 45°C. ➢ Taq polimerasa es estable hasta los 95°C. ➢ En nuestro cuerpo la mayoría de las enzimas trabajan a 37°C que es su temperatura optima, a excepción de las que se encuentran en las gónadas, ya que están trabajan a una temperatura inferior. ➢ Siempre se debe controlar la temperatura de trabajo: - Baños de incubación. - Temperatura de almacenamiento de reactivos, calibradores y controles. Efecto del pH en la actividad enzimática ➢ Siempre se debe trabajar al ph óptimo de la enzima por lo que es necesario controlar la estabilidad de los reactivos. ➢ Si el reactivo se encuentra en mal estado el pH de la reacción va a cambiar y la enzima va a trabajar en otra temperatura. Presencia de inhibidores ➢ Existen los inhibidores de tipo competitivo, acompetitivo y no competitivo. ➢ Los inhibidores modifican Km y/o Vmax. ➢ Siempre se debe considerar la presencia de inhibidores, ya sea por las características de la muestra o por el tipo de anticoagulante que se usó. Presencia de activadores ➢ Compuestos orgánicos: - Activadores alostéricos. - Agentes reductores (BME). ➢ Iones inorgánicos: - Cationes metálicos efecto específico. ➢ Siempre comprobar la presencia cofactores en exceso para realizar la reacción. Taq polimerasa → Mg2+ Piruvato kinasa → K+ Hexokinasa → Mg2+ → A mayor concentración enzimática la curva de progreso se desplaza hacia la izquierda y la pendiente se hace más pequeña. Obtenemos mayor cantidad de producto por unidad de tiempo. → A menor concentración enzimática la curva de progreso se desplaza hacia la derecha y la pendiente se hace más larga. Obtenemos menor cantidad de producto por unidad de tiempo. → Cuando observamos la curva a los dos minutos nos damos cuenta que la curva A se encuentra produciendo más producto que las otras. → Si una muestra contiene una gran cantidad de enzimas no es posible calcular un delta de absorbancia, porque todo ocurre muy rápido, por lo tanto, se tendría que diluir la muestra para disminuir la enzima presente. Esto nos dice que las enzimas tienen una linealidad que no podemos superar. Si la actividad enzimática es muy alta la fase de retardo y lineal disminuyen, el consumo de sustrato ocurre más rápido y los “tiempos útiles de lectura se acortan”. Parámetros cinéticos Km y Velocidad máxima → El gráfico nos indica que a partir de cierto punto, a medida que va aumentando la concentración del sustrato va aumentando la velocidad de la reacción. → Km se define como la concentración de sustrato a la cual la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima. En otras palabras, nos habla de la afinidad que tiene la enzima por el sustrato. Mientras mayor es Km, menor es la afinidad y mientras menor es Km, mayor es la afinidad. → Vmax se define como el momento cuando la enzima se encuentra saturada y trabaja a la mayor velocidad posible. → Para que la enzima trabaje a su Vmax que es lo óptimo, se le tiene que agregar bastante sustrato, por lo menos 10 veces el valor de la Km. Concentración de sustrato → Se debe trabajar en la zona de concentración de sustrato que es lineal, en donde la velocidad de reacción o la formación de producto con respecto al tiempo es directamente proporcional con la concentración de sustrato. → Se definen reacciones de orden cero (independientes de la concentración de sustrato) y de primer orden (proporcional a la concentración de sustrato). → La determinación de actividad enzimática implica reacciones de orden cero en donde el sustrato no es un limitante, mientras que la determinación de ciertos analitos a través de enzimas implica reacciones de primer orden.

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Enzimología clínica

Asignatura: Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II (Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II)

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Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio II

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Componentes sanguíneos

→ Luego de que la muestra llega al laboratorio, se debe procesar para dividir los componentes líquidos (plasma) y los

elementos formes.

→ La cantidad de plasma presente en la muestra va a depender del hematocrito, que es la cantidad porcentual de

glóbulos rojos presentes.

→ El valor normal del hematocrito es aproximadamente 40%, por lo que el 60% corresponde a plasma.

→ La determinación analítica de distintos compuestos requiere ciertos requisitos de anticoagulantes presentes en la

muestra.

→ El plasma se encuentra conformado por:

- 92% de agua, en la cual están disueltos algunos compuestos.

- 7% corresponde a proteínas plasmáticas: albumina (60%), globulinas (35%), fibrinógeno (4%), proteínas regulatorias

como las enzimas (menor a 1%).

- 1% de otros solutos como electrolitos, nutrientes orgánicos y desechos orgánicos.

Proteínas plasmáticas

➢ Las proteínas plasmáticas se dividen en dos fracciones principales: albúmina y globulinas.

➢ La clasificación general de las proteínas plasmáticas es la albumina y las globulinas, quien incluye a todo el resto

de proteínas (Albumina + Globulinas = Proteínas totales).

➢ La función de la albumina es la mantención de la presión oncótica.