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PGM-Téncicas de cuantificación microbiana y sus aplicaciones dentro de la industria
Química Farmacéutica (Quí0110)
Universidad Nacional Autónoma de México
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Técnicas de cuantificación
microbiana
¿Por qué es importante conocer la cantidad de
microorganismos?
Imagina que deseas preparar una bebida fermentada: vino,cerveza,whiskey......¿Cuántos microorganismos necesitas para que transformen los carbohidratos del sustrato que estés utilizando y lo conviertan en etanol? Uno, dos,cien mil, un millón?
Imagina que deseas producir un antibiótico: ¿Cuántos microorganismos necesitas para que transformen un litro del sustrato del medio de cultivo que estas utilizando y lo conviertan en el antibiótico? Uno, dos, cien mil, un millón?
Éstos ejemplos te darán una idea de la importancia que tiene conocer la cantidad de microorganismos que se requieren para ser utilizados y/o detectados en muchos procesos y procedimientos y asegurar la calidad y seguridad de los mismos.
En ésta práctica conoceremos los métodos más utilizados para la cuantificación microbiano, su utilidad y aplicación y aprenderemos a elegir el más adecuado para cada caso que se nos presente.
Cuentas directas:
- Cámaras de conteo
- Contadores electrónicos - citometría de flujo.
Medición de la masa celular
- Análisis de peso seco
- Medición de componentes celulares.
- Turbidez
Métodos de conteo viables:
- Vertido y extensión placa.
- Técnica de filtro de membrana.
- Turbidez para el número más probable (MPN)
Métodos para la determinación de número de microorganismos
Cuentas directas: Cámara de Neubauer
Ésta técnica implica el uso de una cámara llamada de Petroff-Hausser , Cámara de Neubauer o hematocitómetro.
La cámara es un portaobjetos que tiene cuatro canales y un áreacentral con dos cuadrículas grabadas. La cámara está calculada para que al poner un portaobjeto llamado cubrehematímetro , (muy caro!!! $100,no lo rompas!!!)la distancia que quede entre la superficie grabada y el porta sea de 0 y la división más pequeña de la cuadrícula de la cámara mide 0, con éstos datos podemos conocer cuál es el volúmen de la muestra que está sobre la cámara y al contar las células sobre la cuadrícula conoceremos la concentración de nuestra muestra
La muestra se coloca con la ayuda de una Pipeta Pasteur, haciendo que por capilaridad se llene la cuadrícula grabada en el centro de la cámara
Se puede hacer el conteo de las células ò microorganismos presentes en la muestra, utilizando cualquiera de los cuadros; generalmente se recomienda utilizarlos 4 cuadros de las esquinas y el del centro; contar las células de sus 16 cuadros internos y hacer un promedio.... que cada área esta delimitada por tres lineas, sí alguna célula toca esas líneas no se cuenta.
Ejemplo:
En éste ejemplo solo contaron las células en uno de los 25 cuadros, las multiplican por 25 pues es el total del área ocupada por los 0 y los llevan a 1 mL ( multiplicando por 50x10 3 )
En realidad se puede hacer el cálculo utilizando cualquier cuadro de la cámara ó varios de ellos, solo necesitamos saber el área y el volúmen de cabe en ésta área. Para más ejemplos consulta:
Studylib/doc/4540608/formula-de-la-camara-de-neubauer
La suspensión microbiana es forzada a pasar a través de un pequeño orificio iluminado con un haz de luz láser; el paso del microorganismo a través del orificio impacta la corriente eléctrica que fluye a través del orificio y se interrumpe la corriente,se contabilizan los eventos de interrupción de la corriente. Pueden utilizarse también anticuerpos específicos para determinar el tamaño y la complejidad interna de las células.
Cuentas directas: Citometría de flujo
Médición de la masa celular: Turbidez
Para la cuantificación de microorganismos utilizando ésta propiedad, se ha comparado la turbidez que tiene el Sulfato de Bario en diferentes concentraciones. Para ello se hace reaccionar: BaCl 2 + H 2 SO 4 BaSO 4 según las concentraciones y volúmenes descritos en la tabla, obteniéndose suspensiones de Sulfato de Bario que tienen la misma turbidez que la que tienen suspensiones de concentración conocida de bacterias. Por ejemplo: el Matraz No ( el segundo de la derecha) tiene una turbidez igual que la que tiene una suspensión de 300 millones de bacterias/mL, se dice que éste matraz tiene una Unidad McFarland
Médición de la masa celular: Turbidez
Al medir la turbidez de éstas suspensiones de sulfato de Bario llamadas también “estándares de McFarland” , se construye una curva patrón en la que se podrá interpolar la concentración de muestras problema de suspensiones bacterianas
Microorganismos/mL
1 Unidad McFarland= 300 x 10 6 microorganismos/mL
Si una célula está viva o muerta o no, no siempre está claro en Microbiología, con algunos métodos de conteo y/o cultivo no siempre se puede saber, pues los microorganismos pueden estar en un estado que llamamos: VBNC (Viable pero no cultivable), es decir están vivos pero no les damos las condiciones para que puedan reproducirse. Cuando conocemos perfectamente todas las condiciones para que se reproduzcan en el laboratorio, les llamamos Viables Cultivables continuación mencionaremos los métodos de cuantificación que se utilizan para el conteo de microorganismos viables.
Métodos de conteo de viables (VIVOS)
La muestra diluida de bacterias se extiende sobre la superficie de agar sólido o se mezcla con agar y se vierte en una placa de Petri. Después de la incubación, el número de organismos se determina contando el número de colonias multiplicado por el factor de dilución. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (UFC)
Microorganismos/mL= UFC x 1/Factor de dilución
Técnica de vertido ó extensión en placa
PGM-Téncicas de cuantificación microbiana y sus aplicaciones dentro de la industria
Materia: Química Farmacéutica (Quí0110)
Universidad: Universidad Nacional Autónoma de México
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