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Guia 1er TP Citogen ®tica 1C2019
Genética médica (Genética)
Universidad Autónoma de Santo Domingo
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TRABAJO PRÁCTICO: MITOSIS y CITOGENÉTICA HUMANA
A) MITOSIS
Objetivo 1. Realizar una actividad de repaso y reconocimiento sobre las distintas fases de la división mitótica y sus características más importantes. 2. Relacionar los patrones de reconocimiento de cada fase mitótica con los procesos subyacentes y los resultados funcionales de dicho proceso.
Material a utilizar Preparados permanentes de meristemas de raíces de Allium cepa Microscopioóptico
Desarrollo del trabajo práctico
Los alumnos observarán los preparados en el microscopio a 400X y reconocerán las distintas fases de la mitosis cuantificaran en un total de 500 células contadas en por lo menos 3 campos distintos, las distintas fases y registraran los valores obtenidos. Calcularán los siguientes parámetros Índice mitótico (IM): Numero de células en mitosis / 500 células totales observadas Índice de fases (If): Número de células en fase / total de células en mitosis
Responder: a. ¿Cuál podría ser la utilidad de obtener el IM de un tejido proliferante? b. ¿Cómo relacionaría los valores de Ife IM con la duración de la mitosis? c. ¿Cómo relacionaría los diferentes valores de los If con los eventos que transcurren en cada una de estas? d. La condensación de los cromosomas es un factor presente en la división mitótica¿Con que otro evento se podría correlacionar? e. ¿Cuál de las fases es más adecuada para la observación de la morfología cromosómica? ¿Por qué es necesario inhibir la formación de los microtúbulos e inducir la hipotonía?
B) CITOGENÉTICAH U M A N A
Introducción
La Citogenética es el campo deestudiosobre la estructura y organizacióndel genoma eucariota así como su composición molecular y genómicabasada en análisis cromosómicos. Los cromosomas son unidades de cromatina que portan una determinada secuencia de ADN en asociación con ARN y proteínashistónicas y no histónicas. Elnúmero y la estructura cromosómica en eucariotas caracterizan grupos taxonómicos y en última instancia las especies.
La estructura y morfología de los cromosomas eucarióticos se visualiza y define cuando la cromatina presenta máximo grado de compactación y el ADN se encuentra duplicado formando 2 cromátides. La observación de células en división meióticatambién aplica las mismas técnicas aunque los objetivos de los estudios están orientados ala búsqueda depatrones característicos en la meiosis como es el entrecruzamiento, los quiasmas, las regiones homólogas que se manifiestan en el apareamiento de los cromosomas, etc, para estudios evolutivos, clínicos poblacionales etc. La técnica de observación de cromosomas fue llevada a cabo por Tjio y Levan en la década del 50 y fue a partir de ese momento que la citogenética amplió su campo de estudio integrando los conocimientos provenientes de la genética mendeliana, la mutagénesis yla genética molecular. Los campos de aplicación más relevantes son el diagnóstico clínico, la evolución cromosómica, el mejoramiento genético, la evaluación genotoxicológica.
Las técnicas citogenéticas incluyen el bandeo cromosómico, siendo el bandeo G el más utilizado para identificary diferenciar a los cromosomas, aunque existen otras técnicas de bandeo citogenético. La citogenética molecular aplica hibridación de sondas de ADN reveladas por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación genómica comparativa (CGH).
Metodología parael estudio de morfología cromosómica en células humanas
Los cromosomas metafásicospermiten el estudio de la morfología de los cromosomas y la determinación del número modal o número cromosómico más frecuente. Dado que esta fase es bastante corta, la proporción de metafases en una población de células proliferantes es en general, escasa. Para facilitar el análisis se puede enriquecer el tejido en células metafásicas al incorporar al medio un inhibidor del huso mitótico como la colchicina u 8-Q (este último es de preferencia en meristemas). Se pueden identificar 2 métodos generales para la obtención de células mitóticas Métodos directos: Las células mitóticas se obtienen a partir de tejidos proliferantes que se extraen y se extienden o aplastan en un portaobjeto y se observan con una tinción adecuada estos tejidos las células están en división mitótica espontánea (por ej.: meristemas, médula ósea, mucosas) Métodos de cultivo: pueden ser cultivos primarios (ej: fibroblastos) o líneas celulares (HepG2, Hep-2, HeLa, etc.) que proliferan espontáneamente en un medio de crecimiento, Metodos de cultivo con estimulación:las células deben ser estimuladas con un agente mitógeno, para inducir la desdiferenciación y el reinicio de la división mitótica (por ej.: linfocitos de sangre periférica, siendo éstos los más utilizados en citogenética humana). Para los análisis cromosómicos clínicos, las células tienen que crecer y dividirse rápidamente en cultivo. Las células más accesibles que cumplen estos requisitos son los leucocitos de la sangre, en especial los linfocitos T.
Cultivo de linfocitos de sangre periférica
La muestra sangre periférica se obtiene por venopunción, mezclándola conheparina para impedir su coagulación. La sangre puede usarse entera o aislando los leucocitos por centrifugación. Las célulasse colocan en un medio de cultivo y se estimulan para que se dividan con un agente mitógeno. Al cabo de unos cuantos días de incubación, las células en división se detienen en metafase mediante la inhibición del huso mitótico con agentes químicos o frío. Posteriormentelos cultivos se retiran de incubación y se tratan con una solución hipotónica para que la membrana nuclear se rompa al realizar el extendido y los cromosomas se separen. Se coloca fijador para detener el proceso yfinalmente se extiende la fijación sobre un portaobjeto y se tiñen con una de las técnicas disponibles. Los cromosomas ya están listos para su análisisbásico. El análisis del cariotipo a nivel citológico puede ser complementado por cariotipado molecular, es decir, la aplicación de las técnicas citomoleculares para la evaluación de la integridad y las características del cariotipo a nivel del genoma completo. Los niveles de resolución, sensibilidad y facilidad del análisis de los cromosomas y del genoma son cada vez mayores.
Análisis citogenético
En metafase cada cromosoma está formado por dos cromátidas hermanas unidas por el centrómero, que controla la segregación cromosómica durante la división celular. El centrómero divide al cromosoma en brazos: el brazo corto se llama p y el brazo largo se llama q, y tiene una posición fija y única para cada cromosoma. Ésta puede ser medial (cromosoma metacéntrico), submedial (cromosoma submetacéntrico), subterminal (cromosoma acrocéntrico) o terminal (cromosoma telocéntrico) (Fig. 2).
Figura 2: Morfología cromosómica
El idiograma de un cromosoma es un mapa que muestra la relación entre los brazos, el centrómero y la presencia de tallos y satélites. En el idiograma se ilustra, también, el patrón de bandas específico de ese cromosoma. Por otro lado, el cariograma es el ordenamiento sistematizado de los cromosomas de una única célula. Tras el análisis al microscopio óptico se toman imágenes de aquellas células en metafase que sean de la mejor calidad. Laobservación de 15 a 20 células con un análisis completo de al menos 5 de ellas permite disponer de los cromosomas de a pares según su tamaño y bandeo, definiendo así el cariotipo del individuo en cuestión. El número, la morfología (dada por el tamaño y posición del centrómero) y la estructura de los cromosomas definen las constantes cromosómicas. Las metodologías de bandeo (ver más adelante) han hecho posible el análisis detallado de la estructura cromosómica.
El cariotipo humano Las células somáticas de Homo sapiens sapiens contienen 23 pares de cromosomas homólogos (22 pares de autosomas y un par sexual: XX en la mujer, XY en el varón). En humanos se utiliza una nomenclatura específica: primero se escribe el número cromosómico (2n), seguido por la descripción del par sexual, y a continuación se indica la alteración cromosómica, si la hubiere. Por ejemplo: la nomenclatura correspondiente a los complementos cromosómicos normales es 46,XX (mujer) y 46,XY (varón). Los 23 pares cromosómicos presentan diferente tamaño y morfología. Según las variables cromosómicas, se distinguen 7 grupos de cromosomas humanos; los autosomas se enumeran del 1 al 22 en orden decreciente de tamaño (Tabla 1, Fig. 3).
Tabla 1
Figura 3: Los cromosomas humanos ordenados según los diferentes grupos.
Figura 6: Representación esquemática del cariotipohumano en el estadio de 400 bandas con bandeoG.
Figura 7: Representación esquemática del cromosoma 14 con bandeo G en estadio de 320 bandas (izquierda), 500 (centro) y 900 (derecha); ilustrando el uso del Sistema Internacional de Nomenclatura para designar a las regiones, bandas y sub- bandas cromosómicas.
Objetivo del TP 1. Experimentar el conteo y reconocimiento de cromosomas en preparados provenientes de linfocitos de sangre periférica(LSP) y línea celular humana HEp-2 (human epidermoidlaryngeal carcinoma) 2. Familiarizarse con el reconocimiento de los grupos cromosómicos en los preparados celulares de LSP. 3. Observar patrones de Bandas G en los preparados y comparar con figuras preestablecidas con el objetivo de reconocer alguno de los cromosomas del esquema en el preparado.
Material a utilizar Preparados de cultivos de linfocitos de sangre periférica humana (LSPH) con y sin bandeo Preparados de cultivos celulares HEp-2 con y sin bandeo Microscopio
Desarrollo del Trabajo Práctico
Observación de preparados LSPH al microscopio óptico: Los alumnos recorrerán los preparados a 100X y 400X tratando de localizar células en metafase. El objetivo de esta parte es observar metafases y tratar de determinar el número cromosómicomediante el conteo de los cromosomas presentes en cada metafase. Algunos vidrios corresponden a metafases con tinción estándar (o tinción uniforme) y otros, bandeo G. Pueden verse con aceite de inmersión sin necesidad de ponerles cubreobjetos. ¡¡¡NO olvidar limpiar la lente del microscopio al terminar de usarlo!!! Observación de preparados provenientes de líneas celulares HEp-2: Seguir las indicaciones que en el ítem anterior, y contar el número de cromosomas de las células. Es probable encontrar células tengan un número muy diferente a 46 con frecuencia. Investigar las características de la línea en relación con el número cromosómico o ploidía que la caracteriza. Obtener un número modal a partir del conteo de 30 metafases. Identificar por lo menos 3 grupos cromosómicos de acuerdo al tamaño. Observar algún preparado con bandeo G y reconocer algún cromosoma por comparación con el esquema de la guía.
Responder
¿Cuál es el númeromás frecuente encontrado en los LSP humana? Y en la línea HEp-2? ¿Cuántos grupos pudo reconocer de acuerdo al tamaño de los cromosomas humanos? ¿Y a su morfología? ¿Qué cromosomas pudo identificar en preparados con bandeo cromosómico?
Confección del cariotipo (actividad interactiva): Los alumnos realizarán un ejercicio de simulación con imágenes digitales obtenidas de la siguiente dirección de internet: biologia.arizona/human/act/karyotyping/karyotyping2.html. El ejercicio involucra la comparación de los cromosomas por su tamaño, la ubicación del centrómero y la secuencia de bandas G. Los cromosomas se ordenarán en un cariotipo completo y se interpretarán los resultados como si se estuviera trabajando en un servicio de genética médica de un hospital. El cariotipo se completará electrónicamente para tres casos, buscando alteraciones citogenéticas que puedan explicar el fenotipo de los pacientes.
BIBLIOGRAFÍA
Glass, B.; Kistler, J. Distal hyperextensibility of the thumb Genet Statist. Med. 4:192-206, 1953 Hsu, T. Tongue upfolding: a newly reported heritable character in man. J. Hered. 39:187-188, 1948. Reed, D.; Nanthakumar, E.; North, M.; Bell, C.; Bartoshuk, L.; Price, R. Localization of a gene for bittertaste perception to human chromosome 5p15 (Letter) Am. J. Hum. Genet. 64:1478-1480, 1999. Rozental, S; Navarro, R y Alba, L. 1995. Guía de Trabajos prácticos. Curso Anual Teórico Práctico de
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Materia: Genética médica (Genética)
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