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Accoppiamento fra cromatografia e spettrometria di massa

Accoppiamento fra cromatografia e spettrometria di massa, confronti ed...

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CHIMICA ANALITICA

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Università degli Studi di Urbino Carlo Bo

Anno accademico: 2017/2018

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CHIMICA ANALITICA

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Accoppiamento fra tecniche cromatografiche e

spettrometria di massa

Le principali tipologie di accoppiamento fra le cromatografie GC e HPLC e la spettrometria di massa sviluppate sono:

Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)

Ionizzazione ElectroSpray (ESI)

HPLC-MS Particle Beam (PB)

diretto (per GC con colonne capillari)

GC-MS con interfaccia (a getto, a tubo/membrana porosi)

Tecnica Tipologia di accoppiamento

Accoppiamento GC-MS

Colonne impaccate In questo caso il flusso di gas eluente dalla colonna è troppo elevato (da 10 a 40 mL/min) perché lo si possa introdurre direttamente all’interno della sorgente di ionizzazione dello spettrometro di massa, che è posta sotto vuoto. Occorre quindi inserire, fra gas cromatografo e spettrometro di massa, un’interfaccia che elimini parte del gas di trasporto:

Separatore a getto (Becker-Ryhage)

L’estremità della colonna GC termina in una camera sotto vuoto e si affaccia sull’ingresso dello spettrometro di massa. Le molecole di gas di trasporto (azzurre), di solito più piccole di quelle di analita (arancione), vengono allontanate dal flusso molto più efficacemente, mediante una pompa rotativa.

pompa rotativa (10-2torr)

GC MS

Colonne capillari In questo caso il flusso di gas eluente dalla colonna è sufficientemente piccolo (pochi mL/min) da consentire il suo ingresso diretto nella sorgente di ionizzazione.

Oltre ai quadrupoli in GC-MS vengono impiegati analizzatori a trappola ionica o ToF. I sistemi ToF consentono la registrazione di spettri di massa in tempi rapidissimi.

La linea di trasferimento è di solito un tubo capillare riscaldato a temperature paragonabili a quelle del forno gas-cromatografico, in modo da evitare la ricondensazione degli analiti prima dell’ingresso nello spettrometro.

Modalità di analisi in GC-MS

A differenza degli altri rivelatori GC lo spettrometro di massa non fornisce direttamente un responso (ad es. dell’intensità di corrente in un FID) al passaggio di un analita.

Durante l’eluizione cromatografica esso acquisisce continuamente, con un’opportuna frequenza, spettri di massa, che vengono conservati nel computer che gestisce lo strumento.

Il cromatogramma GC-MS viene ricostruito mediante un’elaborazione di tali spettri, che può avvenire secondo due modalità:

Total Ion Current (TIC)

Si acquisisce uno spettro di massa su ampio intervallo di rapporto m/z (di solito da 50 a 2000) del gas effluente dalla colonna cromatografica.

Il computer somma le intensità dei picchi presenti nello spettro di massa ottenuto ad un certo tempo durante la corsa cromatografica.

Il dato risultante (abbondanza) viene usato come ordinata del punto corrispondente a quel tempo nel cromatogramma GC-MS.

Analisi qualitativa in GC-MS

L’ottenimento di spettri di massa sottesi ai picchi via via eluiti nel cromatogramma consente di avviare ricerche in banca dati per risalire all’identità dei composti corrispondenti:

Il confronto, in modalità automatizzata, con le centinaia di migliaia di spettri di massa conservati in opportune banche dati consente molto spesso di identificare direttamente un composto incognito:

La modalità SIM è utile soprattutto quando si vuole cercare un particolare analita all’interno di miscele complesse, che in modalità TIC forniscono solitamente decine (o anche centinaia)

di picchi diversi: SIM

Poiché la scansione SIM è molto più breve di quella TIC è possibile ricostruire un picco cromatografico con molti più punti rispetto al caso della TIC, dunque in modo più fedele:

SIM TIC

E’ possibile costruire un cromatogramma simile ad un tracciato SIM anche a partire da un’acquisizione TIC, imponendo al computer di estrarre dagli spettri MS totali soltanto l’intensità relativa allo ione con il rapporto m/z desiderato.

Il tracciato ottenuto viene definito Cromatogramma di Corrente Ionica Estratta (eXtracted Ion Chromatogram, XIC, talvolta indicato anche con l’acronimo EIC):

TIC

XIC

Interfaccia Particle Beam (PB)

Anche se non è storicamente la prima sviluppata, l’interfaccia PB, introdotta nel 1984, è la prima che abbia dimostrato una discreta applicabilità pratica in HPLC-MS.

L’eluente proveniente dalla colonna HPLC viene trasformato in aerosol all’interno di un nebulizzatore, l’aerosol viene desolvatato in una camera riscaldata e le molecole di analita in esso presenti vengono selezionate da un sistema di skimmerper l’ingresso nello spettrometro di massa.

Principio dello skimmer Le particelle di analita (arancione) liberate nella camera di desolvatazione tenderanno, essendo di solito più grandi (e quindi più pesanti), a mantenere la traiettoria rettilinea che collega l’orifizio del nebulizzatore all’asse degli skimmer.

Vantaggi e svantaggi dell’interfaccia PB

Tipicamente è possibile ottenere spettri MS di tipo EI o CI, ricchi di informazioni sulla struttura molecolare

E’ compatibile con flussi di fase mobile relativamente elevati (0-0. mL/min)

 La sensibilità è bassa, perché parte dell’analita viene inevitabilmente persa attraverso gli skimmer, specialmente se è leggero

Non è compatibile con l’uso di tamponi non volatili

Può indurre degradazione termica negli analiti

skimmer 1

skimmer 2

MS

In ESI l’analita è di solito già presente come ione (positivo o negativo) nella fase mobile HPLC, grazie all’azione di acidi/basi.

Nel caso sia carico positivamente il suo controione (negativo) si scarica sulle pareti del capillare di spray, mentre l’accumulo di cariche positive fa assumere alla soluzione in uscita una caratteristica forma a cono (cono di Taylor), dovuta alla repulsione elettrostatica fra loro.

Quando la repulsione vince la coesione garantita dalla tensione superficiale della fase mobile dal vertice del cono di Taylor si staccano prima filamenti di liquido e poi, da questi, gocce cariche di dimensioni relativamente grandi.

Il processo che porta alla formazione di singoli ioni dell’analita, eventualmente solvatati, a partire dalle gocce può avvenire secondo due meccanismi:

Fissione coulombiana

A B C

A. Le gocce più grandi rimpiccioliscono per evaporazione del solvente

B. La concentrazione delle cariche positive in un volume inferiore fa aumentare la repulsione fino a superare la tensione superficiale: la goccia esplode in gocce più piccole

C. Il processo prosegue a catena fino ad arrivare al singolo ione, che può essere dotato di più cariche positive [M + nH]n+.

qRY carica-limite  0 permittività del vuoto  tensione superficiale del solvente R raggio della goccia

Limite di Rayleigh

Assistenza pneumatica nel processo ESI

Nella maggior parte delle interfacce ESI un flusso di gas inerte (azoto) principale (nebulising) ed eventualmente uno ausiliario (drying) vengono impiegati per facilitare l’evaporazione del solvente dalle goccioline, nonché per direzionare l’aerosol verso il foro d’ingresso dello spettrometro di massa.

Inizialmente l’interfaccia ESI assistita pneumaticamente fu definita Ion- Spray, tuttavia questo termine è ormai in disuso.

Un esempio di spettrometro HPLC-ESI-MS

HPLC

infusione con siringa

interfaccia ESI

ottapoli

trappola ionica

rivelatore

sensore per il vuoto

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